景艷艷，李世杰，陳茂彬，蔣 威，方尚玲

（教育部發(fā)酵工程重點實驗室，湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，湖北 武漢430068）

梔子果是茜草科植物梔子的果實，含有兩種色素：梔子苷（京尼平苷）和類胡蘿卜素類的梔子黃色素（藏花素）。梔子黃色素精制過程洗脫的廢液中含有梔子苷。研究表明：梔子苷在β－葡萄糖苷酶或β－半乳糖苷酶的作用下，可與伯氨基酸（α－氨基酸）發(fā)生聚合反應(yīng)，生成藍(lán)色色素[1］。近幾年來，用于生產(chǎn)β－葡萄糖苷酶的菌株多為黑曲霉、木霉等霉菌屬，桿菌屬的菌株較少。作者從土壤及菌種保藏室中篩選到4株霉菌、2株桿菌，并利用它們將梔子黃色素精制廢液（梔子黃廢液）轉(zhuǎn)化為梔子藍(lán)色素，變廢為寶，以充分循環(huán)利用梔子資源。

1 實驗

1.1 材料、菌株與培養(yǎng)基

梔子果，市售。

蘇云金芽孢桿菌BT、蘇云金芽孢桿菌BT－140、巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌BT－7216、嗜熱脂肪桿菌和枯草芽孢桿菌，分別編號1?！?＃，湖北工業(yè)大學(xué)菌種保藏室。

桿菌斜面培養(yǎng)基[2］：葡萄糖2%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，NaNO30.3%，瓊脂2%，pH 值7.0。

桿菌種子培養(yǎng)基[2］：葡萄糖2%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，NaNO30.3%，pH 值7.0。

桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮2%（麩皮加水煮沸后經(jīng)4層紗布過濾得到的濾液），蛋白胨2%，梔子黃廢液10%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2%，pH 值7.0。

初篩培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，梔子黃廢液10%。

平板分離培養(yǎng)基：梔子黃廢液10%，谷氨酸鈉0.1%，蛋白胨0.5%，KH2PO41%，MgSO4·7H2O 0.05%，瓊脂2%。

PDA培養(yǎng)基：土豆20g，葡萄糖2g，瓊脂2g，水100mL，115℃滅菌30min。

霉菌種子培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏0.5%，NaNO30.3%，MgSO4·7H2O 0.2%，KH2PO40.2%。

霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮2%（麩皮加水煮沸后經(jīng)4層紗布過濾得到的濾液），蛋白胨2%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2%，梔子黃廢液10%。

1.2 方法

1.2.1 梔子黃色素的提取

準(zhǔn)確稱取經(jīng)粉碎機粉碎后的梔子果粉末15g，加入150mL水，60℃水浴30min，過濾，得1次提取液；濾渣加100mL水再次浸提，過濾，得2次提取液；濾渣加50mL水第3次浸提，過濾，得3次提取液。將3次提取液混合，備用。

1.2.2 梔子黃色素的精制

1.2.2.1 樹脂的預(yù)處理

AB－8型大孔吸附樹脂經(jīng)除雜、80%乙醇浸泡24h充分溶脹后，用80%乙醇洗至洗出液加等體積水無渾濁現(xiàn)象，再用去離子水洗至無醇味。

1.2.2.2 樹脂的吸附和解吸

稱取1g預(yù)處理后的AB－8型大孔吸附樹脂于250mL錐形瓶中，加入50mL梔子黃色素提取液，于30℃、150r·min－1搖床振蕩過夜至吸附平衡，測吸附前后色素溶液在440nm（梔子黃色素的最大吸收波長）處的吸光度值。

稱取吸附平衡的AB－8型大孔吸附樹脂0.5g，加25mL 60%乙醇，于30 ℃、150r·min－1搖床振蕩24h，測解吸后60%乙醇中梔子黃色素在440nm處的吸光度值。按下式計算吸附率和解吸率：

式中：A1為吸附前梔子黃色素提取液在440nm處的吸光度值；A2為吸附平衡后梔子黃色素提取液在440nm處的吸光度值；A3為解吸后60%乙醇中梔子黃色素在440nm處的吸光度值。

1.2.2.3 梔子黃色素的精制

取吸附平衡的AB－8型大孔吸附樹脂，裝柱。依次用去離子水（4BV）、20%乙醇（5BV）、60%乙醇（6.5BV）進(jìn)行洗脫，流速為1.5mL·min－1。收集60%乙醇的洗脫液，經(jīng)濃縮干燥得梔子黃色素精品。剩余的洗脫液即為含大量梔子苷的梔子黃廢液，再經(jīng)濃縮去醇，置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 梔子藍(lán)色素轉(zhuǎn)化菌的篩選

1.2.3.1 土壤中目的菌株的篩選

初篩：稱取1g土樣加入20mL無菌水充分振蕩制成懸液。吸取1mL土樣懸液于裝有50mL初篩培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，于30℃、180r·min－1搖床培養(yǎng)2d。若搖瓶培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)搖瓶內(nèi)發(fā)酵液變藍(lán)，說明含有目的菌株。

平板分離：取初篩培養(yǎng)基中的菌液作梯度稀釋。取不同稀釋梯度的菌懸液0.2mL涂布在平板分離培養(yǎng)基于30℃PHX型智能生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。挑取能在平板分離培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色菌圈的菌株劃線分離，得到單菌落。

復(fù)篩：挑取單菌落接種到初篩培養(yǎng)基中，于30℃、180r·min－1搖床培養(yǎng)2～3d，發(fā)酵液轉(zhuǎn)藍(lán)的搖瓶對應(yīng)的菌株即為目的菌株，將其接種到PDA培養(yǎng)基上作菌種斜面保藏。

1.2.3.2 桿菌的篩選

分別挑取5環(huán)斜面活化后的桿菌于種子液中，于35℃、180r·min－1搖床培養(yǎng)10h，以10%接種量接種到桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)24h，發(fā)酵液轉(zhuǎn)藍(lán)所對應(yīng)的菌株即為目的菌株。

1.2.4 目的菌株轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵培養(yǎng)

將篩選得到的目的菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵培養(yǎng)：4株從土壤中篩選得到的目的菌株在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d再轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基于30℃搖床培養(yǎng)5d，轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵液稀釋10倍；蘇云金芽孢桿菌BT－7216和枯草芽孢桿菌在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)10h后以10%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，平行實驗3次，轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵液稀釋3倍。

取上述發(fā)酵液以10 000r·min－1離心10min，取上清液檢測590nm處吸光度值。以去離子水為對照。

按下式計算發(fā)酵液色價（E1%1cm）：

式中：OD590為吸光度值；f為稀釋倍數(shù)；V為發(fā)酵液總體積的1%，mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 AB－8型大孔吸附樹脂的吸附、解吸效果

實驗發(fā)現(xiàn)，AB－8型大孔吸附樹脂對梔子黃色素的吸附率達(dá)到88.92%、解吸率達(dá)到95.38%，吸附率和解吸率都較高，可用于梔子黃色素的精制。

2.2 梔子黃色素精制前后吸收光譜分析（圖1）

圖1 梔子黃色素提取液（a）、梔子黃廢液（b）、梔子黃色素精制品（c）的吸收光譜Fig.1 The absorption spectra of gardenia yellow pigment extract（a），gardenia yellow waste（b）and purified gardenia yellow pigment（c）

由圖1可知，梔子黃色素提取液的吸收光譜中，峰1在440nm處，為藏花素和藏花酸的特征吸收峰，梔子黃色素是一種罕見的水溶性類胡蘿卜素，主要成分是類胡蘿卜素類的α－藏花素和藏花酸[3］；峰2為雜質(zhì)峰；峰3在325nm附近，為綠原酸的特征吸收峰；峰4在238nm處，為梔子苷的特征吸收峰。梔子黃廢液的吸收光譜中，梔子苷的含量很高，已經(jīng)超出了最大測量值，說明梔子黃廢液可以作為梔子藍(lán)色素微生物轉(zhuǎn)化的原料。梔子黃色素精制品的吸收光譜中，梔子苷的吸收峰不明顯，由此可見梔子黃色素精制后梔子苷的含量明顯減少；同時325nm處的吸光度與440nm處的吸光度比值由2.32下降到1.16，說明精制過程中除去了大量綠原酸。

2.3 轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵液吸收光譜分析

土壤中目的菌株的初篩培養(yǎng)液以及桿菌篩選發(fā)酵液都有藍(lán)色色素，為確定該色素是否為梔子藍(lán)色素，對轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵液進(jìn)行吸收光譜掃描，見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵液的吸收光譜Fig.2 The absorption spectrum of the fermentation broth for converting blue

由圖2可知，590nm處有一吸收峰，這與梔子藍(lán)色素的最大吸收波長為590nm相一致[4］，可確定梔子黃廢液經(jīng)微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化為了梔子藍(lán)色素。

2.4 桿菌的篩選

7株桿菌中有6株發(fā)酵液有顏色變化，測定其580～600nm處吸光度值，發(fā)現(xiàn)6株桿菌轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵液的吸收峰值都在590nm附近。7株桿菌發(fā)酵轉(zhuǎn)藍(lán)情況比較見表1 。

表1 7株桿菌發(fā)酵轉(zhuǎn)藍(lán)比較Tab.1 Comparison of the fermentation for converting blue of the seven Bacillus strains

由表1 可知，7株桿菌的轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵液稀釋3倍后吸光度值較大的是蘇云金芽孢桿菌BT－7216和枯草芽孢桿菌，同時兩者發(fā)酵液的顏色呈藍(lán)色，色澤較好。因此，選擇蘇云金芽孢桿菌BT－7216和枯草芽孢桿菌進(jìn)一步馴化比較。

2.5 梔子黃廢液轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵

從土壤中篩選得到4株目的菌株，分別編號1?！?＃，其菌落形態(tài)見圖3。

圖3 4株目的菌株的形態(tài)Fig.3 Morphology of the four object strains

由圖3可知，4株目的菌株屬于霉菌屬。

4株霉菌、2株桿菌轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵液的吸光度值和色價見表2 。

表2 4株霉菌、2株桿菌轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵液的吸光度值和色價Tab.2 The absorbance values and color values of fermentation broth of the four molds and the two Bacillus strains

由表2 可知，從土壤中篩選得到的4株霉菌在梔子黃廢液轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵過程中效果較突出的是2＃和4＃菌株，發(fā)酵液經(jīng)稀釋10倍后吸光度值分別達(dá)0.258、0.343，色價（590nm）分別為129.0、171.5；枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌BT－7216轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵液稀釋3倍后，吸光度值分別達(dá)0.326、0.260，色價（590nm）分別為48.9、39.0，其中枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)藍(lán)效果較好。

2.6 討論

（1）在培養(yǎng)過程中，目的菌株可分解培養(yǎng)基中的蛋白胨為氨基酸，同時分泌出β－葡萄糖苷酶，在β－葡萄糖苷酶作用下將梔子黃廢液轉(zhuǎn)化為梔子藍(lán)色素。

（2）本研究的色價計算為發(fā)酵液的色價，而通常是將發(fā)酵液換算成色素粉末來計算色價，那樣其色價將更高。

3 結(jié)論

（1）梔子黃色素提取液經(jīng)AB－8大孔吸附樹脂吸附，裝柱后依次經(jīng)去離子水、20%乙醇、60%乙醇動態(tài)洗脫，除去大量雜質(zhì)得到高純度的梔子黃色素，梔子黃色素精制后的廢液中含有大量的梔子苷，可用于梔子藍(lán)色素的微生物轉(zhuǎn)化。

（2）經(jīng)初篩、復(fù)篩、轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵培養(yǎng)，從土壤中篩選得到4株霉菌，其中2＃和4＃菌株為優(yōu)勢菌株，轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵液稀釋10倍后590nm處吸光度值分別達(dá)到0.258、0.343，發(fā)酵液色價 E1%1cm（590nm）分別為 129.0、171.5，達(dá)到了國際市場標(biāo)準(zhǔn)。

（3）從菌種保藏室中的7株桿菌中篩選到轉(zhuǎn)藍(lán)效果較好的2株桿菌，其中枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)藍(lán)效果更好，轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵液稀釋3倍后590nm處吸光度值為0.326，發(fā)酵液色價E1%1cm（590nm）為48.9。與霉菌相比，桿菌的轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵液色價較低，但用桿菌轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵周期短、效率高，其應(yīng)用潛力很大，可對其轉(zhuǎn)藍(lán)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，提高轉(zhuǎn)藍(lán)效率。

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[2]方尚玲，劉源才，張慶華，等.細(xì)菌產(chǎn)β－葡萄糖苷酶發(fā)酵優(yōu)化[J］.化學(xué)與生物工程，2007，24（9）：54－58.

[3]李煒.梔子果化學(xué)成分的綜合應(yīng)用研究[D］.北京：北京林業(yè)大學(xué)，2006.

[4]楊志，張芳，李梅，等.梔子藍(lán)色素制備及純化工藝的研究[J］.現(xiàn)代食品科技，2008，24（4）：352－356.