毛鎮(zhèn)偉 朱靈 范鈺

miR-155反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染對人大腸癌Lovo細胞侵襲的影響

毛鎮(zhèn)偉 朱靈 范鈺

目的探討miR-155對人大腸癌細胞侵襲能力的影響。方法 大腸癌Lovo細胞分為3組:脂質(zhì)體介導反義miR-155(AS-miR-155)組、無義寡脫氧核苷酸(ODN)組和對照組。測定熒光素酶活性驗證3組細胞中miR-155的表達，采用Matrigel基質(zhì)生長試驗檢測細胞生長情況，以Transwell方法檢測細胞的侵襲力，結(jié)果 與對照組和無義ODN組比較，轉(zhuǎn)染AS-miR-155組Lovo細胞miR-2l表達水平降低;Matrigel基質(zhì)生長試驗顯示，轉(zhuǎn)染AS-miR-155組Lovo細胞體外培養(yǎng)克隆平均直徑較小，Transwell細胞侵襲試驗顯示轉(zhuǎn)染AS-miR-155組穿膜細胞數(shù)較少。結(jié)論miR-2l高表達可促進Lovo大腸癌細胞侵襲生長，提示miR-155可以作為基因治療大腸癌的候選靶點。

大腸癌;miR-155;侵襲

許多學者發(fā)現(xiàn)，microRNAs的異常表達與多種人類癌癥的發(fā)生密切相關(guān)［1］。研究發(fā)現(xiàn)miR-155在免疫、腫瘤等疾病生理或病理過程中起著重要的調(diào)控作用［2，3］。最近，有學者發(fā)現(xiàn)，miR-155在乳腺癌、大腸癌等多種實體瘤組織或細胞中高表達［4，5］，但目前尚不清楚miR-155在大腸癌細胞侵襲中的作用;本課題組采用寡核苷酸敲低miR-155的表達，觀察了對人大腸癌Lovo細胞生長侵襲的影響。

1 實驗方法

1.1 反義寡脫氧核苷酸(antisense oligodeoxyribonucleotides，AS)轉(zhuǎn)染 大腸癌Lovo細胞在DMEM完全培養(yǎng)液中37℃，5%CO2常規(guī)條件下培養(yǎng)。根據(jù)文獻［6］方法設(shè)計合成寡脫氧核苷酸序列，轉(zhuǎn)染按照試劑說明書操作，空白對照組加入等體積PBS。

1.2 熒光素酶活性檢測 將對數(shù)生長期Lovo細胞消化接種于96孔板，4×103個細胞/孔;培養(yǎng)12 h后進行實驗分組和處理，方法同上。轉(zhuǎn)染24 h后，棄培養(yǎng)基，使用細胞裂解緩沖液充分裂解細胞20 min，加入發(fā)光底物20 μL，孵育10 min后使用ELX800酶標儀測定熒光素酶活性。

1.3 Matrige基質(zhì)生長試驗 具體步驟參照文獻［7］方法進行。連續(xù)觀察15 d，應(yīng)用相差倒置顯微鏡記錄結(jié)果。

1.4 Transwell細胞體外侵襲試驗 該試驗在Transwell板上進行，具體步驟參照文獻［7］方法，于倒置顯微鏡觀察穿過膜細胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學方法 用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 miR-155表達水平 結(jié)果顯示:對照組、無義ODN和AS-miR-155組Lovo細胞熒光強度明顯不同，差異有統(tǒng)計學意義。而兩兩比較顯示轉(zhuǎn)染AS-miR-155組Lovo細胞熒光強度高于對照組和無義ODN組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。說明轉(zhuǎn)染AS-miR-155可有效下調(diào)Lovo細胞中miR-155表達。

2.2 Matrigel基質(zhì)生長試驗 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組和無義ODN組Lovo細胞克隆平均直徑分別為(51.28±6.12)μm和(49.35±6.33)μm，轉(zhuǎn)染AS-miR-155組 Lovo細胞的平均直徑為(28.26±5.38)μm，轉(zhuǎn)染AS-miR-155組平均直徑小于對照組和無義ODN組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3 Transwell細胞體外侵襲試驗 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組和無義ODN組平均每個視野穿膜細胞數(shù)為(70.36±2.8)和(69.2±2.4)，而轉(zhuǎn)染As-miR-155組穿膜細胞數(shù)為(33.5±2.2)，AS-miR-155組穿膜細胞數(shù)小于對照組和無義ODN組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 討論

MicroRNAs是一類短序列、非編碼、具有調(diào)控功能的長約20 nt-24 nt單鏈小分子RNA。大量證據(jù)表明microRNAs的異常表達與多種人類癌癥的發(fā)生密切相關(guān)［1］。MicroRNAs的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，為惡性腫瘤的診斷和治療提供了新的靶點。

癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移是大腸癌治療失敗的主要原因之一，積極尋找與大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子標志物、探討其分子機制，無疑會有助于大腸癌的綜合診療水平。研究表明，miR-155過表達和多種上皮系統(tǒng)來源惡性腫瘤如乳腺癌、大腸癌的發(fā)生及其惡性生物學表型密切相關(guān)［4，5］。但目前尚不清楚其在大腸癌細胞侵襲中的作用。本課題組采用反義寡核苷酸敲低miR-155的表達后，發(fā)現(xiàn)，與空白對照組和無義ODN組比較，miR-155表達下調(diào)后Lovo細胞在Matrigel膠上生長形成克隆的能力降低;且穿過Transwell小室聚碳酸酯膜的能力下降。由此提示，miR-155過表達在大腸癌細胞向周同正常組織的侵襲過程中起重要作用。

本研究說明，miR-155具有正調(diào)控大腸癌細胞侵襲性生長作用，是大腸癌基因治療中的一個頗具前景的候選靶點。

［1］ Tricoli JV，Jacobson JW.MicroRNA:Potential for Cancer Detection，Diagnosis，and Prognosis.Cancer Res，2007，67(10):4553-4555．

［2］ Faraoni I，Antonetti FR，Cardone J，Bonmassar E.miR-155 gene:a typical multifunctional microRNA.Biochim Biophys Acta，2009，1792(6):497-505．

［3］ Tili E，Croce CM，Michaille JJ.miR-155:on the crosstalk between inflammation and cancer.Int Rev Immunol，2009，28(5):264-84.Review.PubMed PMID:19811312．

［4］ Mattiske S，Suetani RJ，Neilsen PM，Callen DF.The oncogenic role of miR-155 in breast cancer.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2012，21(8):1236-1243．

［5］ Bakirtzi K，Hatziapostolou M，Karagiannides I，et al.Neurotensin signaling activates microRNAs-21 and-155 and Akt，promotes tumor growth in mice，and is increased in human colon tumors.Gastroenterology，2011，141(5):1749-1761．

［6］ Yamanaka Y，Tagawa H，Takahashi N，et al.Aberrant overexpression of microRNAs activate AKT signaling via down-regulation of tumor suppressors in natural killer-cell lymphoma/leukemia.Blood，2009，114(15):3265-3275．

［7］ Fan Y，Zhang YL，Wu Y，et al.Inhibition of signal transducer and activator of transcription 3 expression by RNA interference suppresses invasion through inducing anoikis in human colon cancer cells．World J Gastroenterol，2008，14(3):428-434．

Effects of miRNA-155 on invasion of human corectal cancer cell

MAO Zhen-wei，ZHU Ling，F(xiàn)AN Yu.

Cancer Institute，Affiliated People's Hospital of Jiangsu University，Jiangsu 212002，China

Objective To study the effects of miR-155 on invasion of human colon cells.Methods After human colon cancer Lovo cell were transfected by miR-155 antisense miRNA-155(AS-miR-155).The miR-155 knocking down effects was examined by luciferase reporter assay.Matrigel cell growth assay and Transwell assay were used to determine the growth and invasion abilities of cancer cells.Results Luciferase intensity in As-miR-155 treated Lovo cells was significantly suppressed as compared with that in the control groups(P＜0.05).The diameter of cultured clone in As-miR-155 treated Lovo cells was smaller than that in the control groups.Decreased cells via the transwell member in the AS-miR-155 treatment group were detected as compared with those in the control groups.Conclusion

Over-expression of miR-155 induce the growth and invasion abilitiesof human colon cancer cell．

Colorectal cancer;miR-155;Invasion

江蘇省自然科學基金(項目編號:BK2009205);鎮(zhèn)江市科技計劃項目(項目編號:SH2009014)

212002 鎮(zhèn)江，江蘇大學附屬人民醫(yī)院腫瘤研究所

范鈺