肖子曾，邢 瑞，戴 冰，何澤云，周芳亮，劉紅宇，黃開顏，楊賽男

（1湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 湖南 長沙 410007）

六味地黃丸滋補(bǔ)肝腎，滋陰養(yǎng)血，其治療糖尿病具有良好的療效，可以改善糖尿病發(fā)病過程中的葡萄糖代謝異常[1]，調(diào)節(jié)血脂[2]，能減慢糖尿病腎病病變的發(fā)展，具有保護(hù)糖尿病腎病患者腎臟的作用[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在探明六味地黃湯干預(yù)2型糖尿病的作用機(jī)制及其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為其臨床研究提供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 動(dòng)物 30只清潔級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號：SCXK(湘)2009-2004。

1.1.2 藥物 六味地黃方：熟地黃24 g，山茱萸12 g，山藥12 g，牡丹皮9 g，澤瀉9 g，茯苓 9 g。藥材由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。

1.1.3 試劑 枸櫞酸（批號: 100823），磷酸氫二鈉（批號：101125），鏈脲佐菌素（STZ，Sigma，批號：S8050，純度98%）購自Sigma公司，氫化可的松（批號：11021411，天津藥業(yè)焦作有限公司），胰島素（批號：1102229，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司），葡萄糖（批號：110302，成都金山化學(xué)試劑有限公司），環(huán)-磷酸腺苷（cAMP）酶聯(lián)免疫試劑盒（批號：20111206）。

1.1.4 儀器 快速血糖儀及血糖試紙（美國羅氏公司）；ca-958d型半自動(dòng)生化分析儀；WH-1型旋渦混勻器（上海滬西分析儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；TD4-Ⅱ型臺(tái)式自動(dòng)平衡離心機(jī)（長沙平凡儀表有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 六味地黃湯及水提醇沉物的制備 稱取六味地黃方飲片10付，共750 g，加6倍量水，浸泡30 min，煎煮30 min，過濾，再加4倍量水，煎煮30 min，合并兩次濾液，水浴濃縮成濃度為0.75 g/mL的六味地黃湯。取適量濃縮后的六味地黃湯，70%乙醇醇沉處理，靜置24 h，真空抽濾，除去沉淀部分，醇溶上清液濃縮，共得水提醇沉物149.7 g（每1 g水提醇沉物相當(dāng)于生藥2.51 g）。

1.2.2 高脂乳的制備 稱取膽固醇5 g，蔗糖5 g，果糖5 g，丙硫氧嘧啶1 g，谷氨酸鈉1 g，食鹽6 g，量取20 mL吐溫-80，豬油20 g，丙二醇30 mL，加蒸餾水定容至100 mL配成脂肪乳，4℃保存。

1.2.3 2型糖尿病腎陰虛證大鼠模型的建立 空白組普通飼料喂養(yǎng)，其他動(dòng)物高脂乳灌胃10 mL/（kg· d）[4]加普通飼料喂養(yǎng)，10 d后，所有動(dòng)物禁食12 h，模型大鼠腹腔注射STZ 40 mg/kg，空白組注射等體積枸櫞酸 磷酸氫二鈉緩沖液。15 min后，大鼠腹腔注射胰島素4 U，2.5 h和5 h后灌胃給予25%葡萄糖10 mL/kg，72 h后檢測大鼠空腹血糖，F(xiàn)BG≥16.7 mmoL/L的即為2型糖尿病模型大鼠。2型糖尿病模型大鼠禁食12 h，灌胃氫化可的松35 mg/kg[5]，連續(xù)灌胃4 d，期間高脂乳喂養(yǎng)，4 d后測大鼠空腹血糖及血清cAMP，F(xiàn)BG≥16.7mmoL/L且血清cAMP明顯上升者，即為2型糖尿病腎陰虛模型大鼠。

1.2.4 分組給藥 2型糖尿病腎陰虛證模型大鼠隨機(jī)分為六味地黃湯組、六味地黃湯水提醇沉物組、羅格列酮組、模型組，每日分別按六味地黃湯6.75 g/kg（按臨床六味地黃湯每天服用1付75 g生藥折算）、六味地黃湯水提醇沉物2.7 g/kg（相當(dāng)于原方劑量6.75 g/kg）、羅格列酮0.72 mg/kg（按臨床羅格列酮每天服用8 mg折算）的劑量連續(xù)灌胃30 d，其劑量按照70 kg成人與200 g大鼠體表面積換算，模型組、空白組灌服等體積生理鹽水。

1.2.5 標(biāo)本采集 大鼠禁食10 h，腹腔注射10%水合氯醛0.35 g/kg麻醉，斷尾、用快速血糖儀測血糖，解剖、腹主動(dòng)脈取血，靜置，分離血清，-20℃凍存待檢。

1.2.6 指標(biāo)檢測 用ELISA試劑盒檢測血清中cAMP的含量，用半自動(dòng)生化儀檢測血清中CHO、LDL-C、HDL-C、TC的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 2型糖尿病腎陰虛證大鼠體征變化

2型糖尿病腎陰虛證模型大鼠體質(zhì)量下降，精神不振，活動(dòng)減少，反應(yīng)較遲鈍，體毛無光澤、粗糙發(fā)黃暗淡，大便稍干結(jié)，色黑，肛門出現(xiàn)紅腫，飲水增加，進(jìn)食量增加，尿量增加，尿黃，痛閾值降低等，與中醫(yī)腎陰虛證相符合。

2.2 六味地黃湯及其水提醇沉物對2型糖尿病腎陰虛證大鼠血糖、血清cAMP、脂代謝的影響

模型組大鼠與空白組比較，模型組大鼠成模后30 d空腹FBG、血清cAMP仍明顯高于空白組，其CHO、TG、LDL-C水平明顯升高，HDL-C水平降低，比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示造模成功，模型穩(wěn)定，且該模型大鼠脂代謝異常。六味地黃湯組、六味地黃湯水提醇沉物組與模型組比較，大鼠空腹FBG、cAMP、CHO、TG、LDL-C水平明顯低于模型組，比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），HDL-C水平明顯高于模型組，比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；提示六味地黃湯及其水提醇沉物均能降低2型糖尿病腎陰虛證大鼠的空腹FBG、cAMP、CHO、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，且其兩者的作用無差異；六味地黃湯組、六味地黃湯水提醇沉物組與羅格列酮組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示羅格列酮降低2型糖尿病腎陰虛證大鼠FBG及改善脂代謝的作用優(yōu)于六味地黃湯及其水提醇沉物。結(jié)果見表1。

3 討論

2型糖尿病多屬中醫(yī)“消渴”范疇，中醫(yī)認(rèn)為本病的病機(jī)為陰津虧損，燥熱偏盛，而以陰虛為本，燥熱為標(biāo)[6]，2型糖尿病腎陰虛證是（消渴）中醫(yī)辨證的常見癥候。本實(shí)驗(yàn)分離提純制得六味地黃湯水提醇沉物能降低2型糖尿病腎陰虛證大鼠的血糖，改善脂代謝，從而干預(yù)2型糖尿病腎陰虛證。

表1 給藥后大鼠空腹FBG、血清cAMP 、CHO、TG、LDL-C、HDL-C的比較（±s，n=6）

表1 給藥后大鼠空腹FBG、血清cAMP 、CHO、TG、LDL-C、HDL-C的比較（±s，n=6）

注：與空白組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較●P＜0.05, ●●P＜0.01；與羅格列酮組比較△P＜0.05, △△P＜0.01。

組別 給藥劑量（g/kg）FBG（mmoL/L）cAMP（mmoL/L）CHO（mmoL/L）TG（mmoL/L）LDL C（mmoL/L）HDL C（mmoL/L）空白組 6.75 6.0±0.5 0.96±0.06 1.52±0.09 0.83±0.06 0.44±0.03 1.15±0.06模型組 6.75 18.0±2.4** 1.24±0.024**●● 2.21±0.18** 1.57±0.11** 1.04±0.05** 0.76±0.05**●●羅格列酮組 0.72×10-3 13.7±0.5**●● 1.10±0.01** 1.79±0.04**●● 1.25±0.04**●● 0.74±0.03**●● 0.98±0.02**六味地黃湯組 6.75 15.8±0.6**●△ 1.19±0.02**●●△△ 1.93±0.11**●●△ 1.37±0.06**●●△ 0.83±0.02**●●△△ 0.86±0.02**●△△苷類部位組 2.70 15.9±0.6**●●△ 1.17±0.03**●●△△ 1.94±0.04**●●△ 1.38±0.04**●●△ 0.84±0.03**●●△△ 0.87±0.02**●△△

六味地黃湯是滋陰補(bǔ)腎經(jīng)典名方，臨床防治2型糖尿病取得了較好的療效，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)六味地黃湯可以改善2型糖尿病腎陰虛證的癥狀，但降糖效果不顯著；羅格列酮的藥效優(yōu)于六味地黃湯及其水提醇沉物，降糖效果顯著，起效快，但臨床應(yīng)用中副作用大。故以羅格列酮結(jié)合六味地黃湯治療2型糖尿病腎陰虛證可能會(huì)有更好的療效，因此，深入開展對六味地黃湯作用機(jī)制的研究，對于提高2型糖尿病的治療水平有重要意義。

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