邵 敏，劉 寶，王錦權(quán)，陶曉根，潘愛軍，周樹生

（安徽省立醫(yī)院ICU，安徽 合肥 230001）

百草枯（Paraquat，PQ）作為除草劑效果好，成本低廉。因而，在我國使用廣泛。然而PQ使用時中毒病例以及口服自殺者屢見不鮮，因為沒有特效的解毒劑，現(xiàn)已成為人類急性中毒病死率最高的除草劑。PQ中毒在早期引起多器官功能損害。晚期多死于肺間質(zhì)纖維化所致的呼吸衰竭。PQ引起的肺纖維化發(fā)病最快、最典型，而其具體的機制還不明了。以往普遍的觀點認(rèn)為：肺纖維化過程可能是和促纖維化的Th2型T淋巴細(xì)胞反應(yīng)過強， 抗纖維化的Th1型T淋巴細(xì)胞反應(yīng)不足，Th1/Th2失衡有關(guān)。近來發(fā)現(xiàn)了一個新的CD4+效應(yīng)T細(xì)胞亞群 Th17細(xì)胞(以產(chǎn)生大量IL-17A為特征)。Th17具有強致病潛能，通過表達相應(yīng)的細(xì)胞因子（IL-17A、1L-17F、IL-22等致炎細(xì)胞因子），刺激成纖維細(xì)胞分泌IL-8、IL-6、GM-CSF等炎癥因子，激活NF-Κb轉(zhuǎn)錄活性。因而，IL-17A被認(rèn)為極有可能是纖維化形成的又一個重要節(jié)點[1]。本實驗采用定量Elisa法檢測大鼠血漿和肺組織勻漿中IL-17A的表達，以了解IL-17A在PQ致肺纖維化中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

動物：清潔級純系雄性SD大鼠24只（由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供）體質(zhì)量150～250 g，10周齡左右。試劑：20%PQ溶液購買自安徽省瑞豐化肥貿(mào)易有限公司。

1.2 動物分組、模型建立與標(biāo)本處理

通過1次性灌胃給予SD大鼠1、10、20、50 mg/kgPQ進行預(yù)實驗研究，并觀察模型組大鼠肺組織纖維化程度。結(jié)果顯示，20 mg/kgPQ1次性灌胃染毒，7 d后開始出現(xiàn)肺纖維化，14 d大鼠肺組織病理示纖維化達高峰期。

雄性SD大鼠24只隨機分為模型組16只和對照組8只。模型組：給予PQ20 mg/kg1次性灌胃染毒；對照組予以等量生理鹽水灌胃。模型組分別于給藥后7 d和14 d各取8只大鼠，充分麻醉后打開腹腔，從腹主動脈采集動脈血2 mL，注入含EDTA二鈉的抗凝試管中并混勻，在4℃下以3000 r/min離心10 min，分離血漿置于-70℃冰箱保存，待測IL-17A含量。放血活殺大鼠，打開胸腔，取右肺組織, 以10%福爾馬林固定，酒精干燥，石蠟包埋，組織切片，蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色，進行病理學(xué)檢查；另取肺組織盡快放入0.2 moL/L冰醋酸，然后在100℃水浴中煮沸10 min，勻漿，并在4℃下以3000 r/min,離心15 min，取上清液置于-70℃冰箱，供測定IL-17A含量。

1.3 肺泡炎、肺纖維化程度判斷

根據(jù)Szapiel等[2]報道的評分方法判定肺泡炎和肺纖維化的程度。

1.4 血漿和肺組織勻漿IL-17A的測定

測定方法按IL-17A測試盒說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計分析，計量資料以“±s”表示，采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)觀察

對照組HE染色可見到結(jié)構(gòu)完整的肺組織，鏡下肺泡形態(tài)清晰，炎性細(xì)胞無浸潤；Masson染色可見少量藍染的膠原纖維沉積在支氣管周圍及肺泡間隔區(qū)。染毒7 d后病理切片示明顯的肺泡炎性改變，HE染色下可見水腫增厚的肺泡間隔，肺泡結(jié)構(gòu)破壞伴有水腫和輕度出血，并可見炎性細(xì)胞大量浸潤在肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)；Masson染色顯示小灶性膠原形成。14 d肺泡炎較前明顯減輕，炎性細(xì)胞減少，病變范圍彌散，肺泡結(jié)構(gòu)大量萎陷、破壞, 新生的毛細(xì)血管周圍有大量膠原沉積, 膠原和纖維蛋白占據(jù)在肺泡間隔以及部分肺泡腔內(nèi)；Masson染色可見大量膠原沉積。而模型組肺泡炎、肺纖維化程度明顯高于對照組，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果見表1。

表1 肺泡炎和肺纖維化程度分級積分（±s，n=8）

表1 肺泡炎和肺纖維化程度分級積分（±s，n=8）

注：與對照組比較*P＜0.05；與中毒后7 d比較△P＜0.05。

組別 肺泡炎 肺纖維化7 d 14 d 7 d 14 d對照組 0 0 0 0模型組 2.14±0.33* 1.57±0.11*△ 1.23±0.31* 2.16±0.56*△

2.2 肺組織勻漿和血漿IL-17A含量變化

模型組大鼠中毒后肺組織勻漿和血漿IL-17A含量較正常組明顯增加，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。并隨時間的延續(xù)而增加，在14 d肺組織病理纖維化達高峰期，肺組織勻漿和血漿IL-17A也達到峰值。結(jié)果見表2。

表2 對照組與中毒組各觀察時間點IL-17A的變化（±s，n=8）

表2 對照組與中毒組各觀察時間點IL-17A的變化（±s，n=8）

注：與對照組比較*P＜0.05；與中毒后7 d比較△P＜0.05。

組別 IL-17A（pg/mL）勻漿 血漿對照組 20.8±8.4 16.2±6.1中毒組 7 d 80.6±24.2* 66.3±18.6*14 d 150.3±41.3*△ 141.7±33.5*△

3 討論

PQ經(jīng)胃腸道吸收入血后, 肺臟通過多胺攝取途徑可特異性聚集PQ，導(dǎo)致肺臟PQ的濃度比血液高10～90倍[3]因此PQ中毒后肺損傷尤為嚴(yán)重且進展迅速[4]?；颊呷缒芏冗^早期的ARDS期后，肺部損傷逐漸加重，將不可逆發(fā)展為肺間質(zhì)纖維化，后期多死于呼吸衰竭。

本實驗采用ELLSA法檢測PQ染毒后大鼠血漿和肺組織中IL 17A的表達，結(jié)果顯示，PQ染毒后7 d，模型組大鼠肺組織病理切片開始出現(xiàn)纖維化的表現(xiàn)：小灶性膠原形成。染毒14 d，肺纖維化最明顯，此時間點大鼠血漿和肺組織勻漿中IL-17A水平明顯高于對照組和染毒7 d時的大鼠血漿和肺組織勻漿中IL-17A濃度，而IL-17A的濃度與肺纖維化的程度成正相關(guān)。因此，本實驗證實IL-17A在PQ中毒引起的肺纖維化的發(fā)病機制中可能起著重要的作用。

[1]Boniface K,Blom B,Liu YJ,et al.de Waal Malefyt R.From interleukin-23 to T-helper 17 cells:human T-helper cell differentiation revisited[J].Immunol Rev,2008,22(6):132-146.

[2]Szapiel SV,Elson NA,Fulmer JD,et al.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude athymic mouse[J].Am Rev Respir Dis,1979,120(4):893-899.

[3]Chen CM,Lua AC.Lung toxicity of paraquat in the rat[J].J Toxicol Environ Health A,2000,60(7):477-487.

[4]Dinis-Oliveira RJ,Duarte JA,Sanchez-Navarro A,et al.Paraquat poisonings: mechanisms of lung toxicity clinical features and treatment[J].Crit Rev Toxicol,2008,38(1):13-71.