單祝庚，楊 靜

（衡陽市產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，衡陽 421001）

合成著色劑是為了賦予或改善食品色澤而添加到食品中的物質(zhì)，它不是食品的成分，在著色劑合成中可能伴有其他副產(chǎn)品而造成污染，特別是早期使用的合成著色劑很多發(fā)現(xiàn)具有致癌性，因此世界各國對食用合成著色劑都嚴(yán)格控制。目前，我國允許使用的安全性較高的只有8種。對合成著色劑的檢測通常采用國標(biāo)GB／T5009.35－2003高效液相色譜法。

評定不確定度已成為各實驗室在實驗室認可、計量認證復(fù)查和樣品比對工作中的重點，它實現(xiàn)了統(tǒng)一地評價測量結(jié)果的質(zhì)量，在食品添加劑的檢測工作中具有重要的意義［1－2］。本文對高效液相色譜法同時測定葡萄酒中四種合成著色劑的測量結(jié)果合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度進行了分析和評定。

1 實驗方法與儀器

1.1 測量儀器：日本島津LC－10A高效液相色譜儀，SPD－10Avp紫外檢測器

1.2 測量環(huán)境條件：30℃，相對濕度≤55%

1.3 合成著色劑儲備標(biāo)準(zhǔn)溶液：檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃0.500mg／ml，u＝1%（k＝2）（購于中國計量科學(xué)研究院）。

1.4 合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：分別移取上述四種標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.10、0.20、0.40、0.80、1.60mL于10.0mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，配成混合標(biāo)準(zhǔn) 溶 液，濃 度 分 別 為 5.0、10.0、20.0、40.0、80.0μg／mL。

1.5 樣品預(yù)處理：稱取5.0g左右的樣品于100mL燒杯中，水浴加熱驅(qū)除乙醇，按 GB／T5009.35－2003聚酰胺吸附法提取合成色素后蒸發(fā)至近干，加水溶解定容至50.0mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，上機分析［3］。

1.6 色譜條件

1.6.1 色譜柱：Wondasil C18 5μm 4.6 mm×250mm

1.6.2 流動相：乙酸銨（0.02mol／L）：甲醇，梯度洗脫20%～35%，3%／min；35%～98%，9%／min；98%繼續(xù)6min；流速：1mL／min

1.6.3 檢測波長：254nm

2 數(shù)學(xué)模型

測量結(jié)果計算公式：其中x為試樣中色素的含量（mg／kg）；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣中色素的濃度（μg／mL）；V為試樣處理后定容體積（mL）；m為所稱取試樣質(zhì)量（g）。

試樣中色素濃度C（μg／mL）通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，其公式為：

A－峰面積；C－表示濃度；k－斜率；b－截距。

由公式（1）和公式（2）分析可知四種著色劑不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合、峰面積的測量、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、樣品處理后定容的總體積，試樣稱樣量等不確定度因素。

3 不確定度分量的計算及合成

3.1 曲線擬合產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本實驗共選取5個標(biāo)準(zhǔn)濃度，每個標(biāo)準(zhǔn)點重復(fù)測定3次。由于測定結(jié)果數(shù)據(jù)較多，本文選取檸檬黃進行不確定的計算和評定作為其他著色劑的參照。表1列舉了四種著色劑中檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)峰面積的測定結(jié)果。

表1 不同濃度著色劑混標(biāo)中檸檬黃峰面積的測定結(jié)果

以濃度C（μg／mL）為橫坐標(biāo)，峰面積A（mA）為縱坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)分別為A＝68 802C，斜率k＝68 802，γ＝1。

表2 檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)偏差計算結(jié)果

續(xù)表

表3 四種著色劑的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)偏差s

比對樣品中檸檬黃7次重復(fù)測定結(jié)果平均值為53.4 mg／kg，則曲線擬合產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定為：

式中p－樣品測定次數(shù)；n－標(biāo)準(zhǔn)溶液測定次數(shù)；C0－樣品測定平均值；C－－不同標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均值。其他三種著色劑的不確定度的評定按照此法計算，結(jié)果見表4。

表4 其他三種著色劑曲線擬合相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度數(shù)據(jù)

3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程量器校準(zhǔn)產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

表5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中量具校準(zhǔn)引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由表5數(shù)據(jù)合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.3 溫度變化產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

因此，由標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3 樣品制備引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.3.1 樣品稱量產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

稱樣量為5.0g，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3.2 定容體積產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品預(yù)處理后轉(zhuǎn)移入50.0mL容量瓶，并用水定容至刻度。其最大允許誤差為±0.0 2mL，按矩形分布考慮，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.3.3 定容時溫度產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

同3.2.3，其引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1.21×10－3。

由上述評定可知，樣品制備引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.4 測量重復(fù)性產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

表6 相同實驗條件下，7次獨立實驗結(jié)果及相關(guān)數(shù)據(jù)

4 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成：

其中四種著色劑的μ（2）和μ（3）相同，μ（1）和μ（4）數(shù)據(jù)分別見表4和表6，四種著色劑各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量匯總后得到合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：檸檬黃：1.3%；莧菜紅：1.6%；胭脂紅：1.7%；日落黃：1.8%。

5 擴展不確定度

取置信概率95%，包含因子k＝2［5］，以合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子再乘以樣品中各著色劑測定含量進行擴展不確定度計算，比對葡萄酒中四種著色劑依次為：檸檬黃：1.4mg／kg；莧菜紅：1.1mg／kg；胭脂紅：1.2mg／kg；日落黃：1.7mg／kg。

6 測量不確定度報告

比對葡萄酒中四種著色劑的測量結(jié)果為：檸檬黃：（53.4±1.4）mg／kg；莧菜紅：（34.2±1.1）mg／kg；胭脂紅：（34.9± 1.2）mg／kg；日落黃：（46.2±1.7）mg／kg。

7 結(jié) 論

通過對液相色譜梯度洗脫法同時測量葡萄酒中四種著色劑含量的不確定度來源進行分析，并對其不確定度分量進行評定，得出該分析方法的測量不確定度。同時可以看出，HPLC法測定著色劑含量不確定度主要來自標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備、樣品處理操作過程、儀器的校準(zhǔn)和測量重復(fù)性。因此，在測試樣品時，必須嚴(yán)格按照操作規(guī)范，并且使用合格的計量器具，盡量減小測量結(jié)果的不確定度，保證檢測結(jié)果的質(zhì)量。

［1］楊小寧，郭靚，但德忠 .環(huán)境監(jiān)測中儀器分析方法不確定度的評估（Ⅱ）：原子吸收光譜分析中的測量不確定度［J］.四川環(huán)境，2007，26（5）：24－29.

［2］蔡秋，朱明 .高效液相色譜法測定茶飲料中苯甲酸結(jié)果不確定度評定［J］.食品科學(xué)，2007，28（2）：277－280.

［3］周小新，周紅 .離子色譜法測定水中溴酸根離子含量不確定度評價［J］.職業(yè)與健康，2009，25（17）：1827－1829.

［4］杜淑霞.高效液相色譜法測定乳飲料中安賽蜜含量的不確定度評定［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31（2）：142－146.

［5］劉燕，陳國利，彭新凱，等.氣相色譜法測定果凍中甜蜜素結(jié)果不確定度評定［J］.食品與機械，2008，24（2）：111－113.