賀紅艷 張曉麗 趙立斌 賀紅梅

細(xì)胞周期受控于細(xì)胞周期蛋白(cyclinS)、細(xì)胞周期依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)和細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent kinases inhibition，CDKIs)三種調(diào)控因子。當(dāng)細(xì)胞周期啟動(dòng)、運(yùn)行和終止異常時(shí)，可造成細(xì)胞失控性生長，形成腫瘤。P27是CDKI重要成分，對細(xì)胞周期具有顯著抑制作用。cyclinE與CDK結(jié)合形成復(fù)合物，對細(xì)胞周期的啟動(dòng)及各時(shí)相的轉(zhuǎn)換具有關(guān)鍵性調(diào)控作用，在腫瘤的形成中均發(fā)揮了重要作用［1－3］，但在喉鱗狀細(xì)胞癌中有關(guān) P27和cyclinE的報(bào)道較少，我們研究他們在喉癌中的表達(dá)情況，并探討與患者病理特征等因素之間的關(guān)系，旨在探討喉癌的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2004至2008年張家口地區(qū)喉鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)切除標(biāo)本72例，年齡38～70歲，平均年齡52歲。正常喉黏膜21例。

1.2 標(biāo)本處理 標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片6張，切片厚度5μm。

1.3 試劑及染色 采用S-P免疫組織化學(xué)染色方法。鼠抗人P27、cyclinE抗體和S-P試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行。每批實(shí)驗(yàn)陽性對照片用已知陽性片作對照;陰性對照片用PBS液代替一抗。

1.4 染色結(jié)果判定 每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野(×400)，取陽性細(xì)胞均值，凡陽性細(xì)胞數(shù)超過5%定為陽性病例(+)，否則為陰性病例(－)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SAS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)和Spersman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P27和cyclinE在正常喉黏膜及鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá) 光鏡下陽性物為棕黃色，P27分布于細(xì)胞核，cyclinE多分布于細(xì)胞胞核，少數(shù)胞漿也同時(shí)著色。P27和cyclinE在正常喉黏膜中陽性率分別為61.9%(13/21)和23.8%(5/21);在喉癌中的陽性率分別為30.6%(22/72)和51.4%(37/72)，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.2 P27和cyclinE的表達(dá)與喉癌臨床病理學(xué)的關(guān)系 P27、cyclinE在喉癌中的表達(dá)與分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，與發(fā)病部位無性(P ＞0.05)。見表1。

表1 P27和cyclinE的表達(dá)與喉癌臨床病理學(xué)的關(guān)系例(%)

2.3 P27和cyclinE相關(guān)性比較 P27和cyclinE之間的表達(dá)無明顯差異，而且也無相關(guān)性(r=0，P ＞0.05)。

3 討論

喉癌是耳鼻喉-頭頸外科的常見惡性腫瘤，發(fā)病率較高，占耳鼻喉惡性腫瘤的11.6% ～22%。腫瘤發(fā)生的共同特征是細(xì)胞周期控制機(jī)制的紊亂導(dǎo)致細(xì)胞的失控性生長。CDKs和周期素(cyclins)結(jié)合，催化細(xì)胞周期進(jìn)程，而CKIs作為細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子則抑制其活性或結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)中檢測cyclinsE是細(xì)胞周期素中的一個(gè)亞型，對細(xì)胞周期有正調(diào)節(jié)作用;P27則是CDKs家族成員，對細(xì)胞周期有負(fù)調(diào)節(jié)作用。

CyclinE是參與細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換的重要調(diào)節(jié)因子，在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中主要在G1晚期發(fā)揮正常調(diào)控細(xì)胞周期的作用，其作用機(jī)制為:cyclinsE與CDK2結(jié)合形成cyclin E-CDK2復(fù)合物，促使CDK被磷酸化而具有酶活性，在G1/S轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮作用。P27作為細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子，通過兩個(gè)途徑抑制細(xì)胞周期，即抑制CDK激活和抑制激活后的Cyclin-CDK活性。P27對G1期cyclin-CDK抑制作用最為重要，它能顯著抑制cyclin E-CDK2和cyclin E-CDK4復(fù)合物的活性，使細(xì)胞周期停滯于G1期和S期的轉(zhuǎn)換，是G1期限速因子。

大量研究顯示P27與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，如在大腸癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、肺癌、非何杰金淋巴瘤等［3－6］常見腫瘤中均有異常表達(dá)。P27蛋白表達(dá)的異常與癌癥的發(fā)生發(fā)展及存活率相關(guān)，因此P27可作為癌癥演變的一種重要標(biāo)志分子［7］。本研究發(fā)現(xiàn)喉癌組織中 P27蛋白陽性率(30.6%)明顯低于正常組(61.9%)(P ＜0.05)，說明 P27 表達(dá)水平下調(diào)可能促進(jìn)喉癌的發(fā)生。P27在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中陽性率顯著低于無轉(zhuǎn)移組，與國內(nèi)學(xué)者曹華等［8］報(bào)道一致，表明P27蛋白在喉癌的進(jìn)展過程中逐漸喪失了作為細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子的抑制作用，使癌細(xì)胞具有更高的惡性程度和侵襲力，另外P27蛋白缺乏，還可導(dǎo)致細(xì)胞間粘附力下降，使腫瘤容易轉(zhuǎn)移。P27在喉癌中的表達(dá)與分化程度有關(guān)，在高分化組陽性表達(dá)率顯著低于低分化組，提示P27蛋白表達(dá)水平可能作為反應(yīng)喉癌惡性程度及預(yù)后的重要指標(biāo)。

研究表明，cyclinE對腫瘤細(xì)胞的增殖起重要作用，在某些腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)cyclinEmRNA和蛋白的表達(dá)異常，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。cyclinsE基因失調(diào)，蛋白過量表達(dá)見于多種腫瘤如鼻咽癌、胃癌、乳腺癌等［3，9］過度表達(dá)，而且與腫瘤的惡性程度及預(yù)后有關(guān)，已被證明是一種癌基因，具有早期診斷和預(yù)后判斷價(jià)值，并可作為細(xì)胞增殖的又一標(biāo)志。本研究顯示:cyclinsE在正常組陽性表達(dá)率顯著低于喉癌組，表明cyclinsE在喉癌的發(fā)生中起重要作用，并對喉癌的早期診斷具有一定價(jià)值。在低分化喉癌組及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中cyclinsE均有高表達(dá)現(xiàn)象，說明cyclinsE表達(dá)過度與分化不良有關(guān)，并提示預(yù)后不佳。cyclinE的表達(dá)與P27的表達(dá)無相關(guān)性。

目前惡性腫瘤被認(rèn)為是細(xì)胞周期疾病。cyclinsE和P27在喉癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中起著重要作用?，F(xiàn)有學(xué)者將外源性P27基因作為目的基因用于腫瘤的基因治療，可明顯抑制腫瘤的生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡及分化成熟［10］。國內(nèi)陳濟(jì)［11］利用RNA干擾技術(shù)能特意下調(diào)HeLa細(xì)胞中cyclinEmRNA含量，抑制宮頸癌細(xì)胞惡性增值。P27和cyclinE有可能成為未來腫瘤基因治療的目的基因，采用分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步明確其相互作用機(jī)制，將為喉癌的基因治療特別是聯(lián)合多項(xiàng)基因治療提供廣闊的前景。

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