廉紅星 趙敏 劉瑞吉

骨肉瘤(ostcosarcoma)是最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤，約占所有骨腫瘤的20%，常發(fā)生于青少年，一般預(yù)后較差，且易早期發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。故骨肉瘤給患者本身、患者家庭以至社會(huì)都帶來了問題，對(duì)臨床診治提出了挑戰(zhàn)。我們采用免疫組織化學(xué)SP法，觀察了Skp2、p27蛋白在骨肉瘤組織中的表達(dá)情況，并分析了兩者與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 35例骨肉瘤選自2000年1月至2007年12月我院病理科存檔標(biāo)本蠟塊，其中骨肉瘤男22例，女13例，男女比例1.7∶1;年齡11～55歲，平均年齡21歲。骨肉瘤臨床分期參照Enneking分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅲ期12例，Ⅱa 5例，Ⅱb 18例，其中肺轉(zhuǎn)移者24例。全部病例均獲隨訪。另外選取14例骨軟骨瘤作為對(duì)照研究。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 4μm厚度石蠟切片，60℃烤片3 h，SP法免疫組化染色技術(shù)參照福州邁新公司介紹的SP法步驟操作，用蘇木素液復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，水洗返藍(lán)，酒精梯度脫水，二甲苯透明，封固切片。用磷酸鹽緩沖液(PBS)取代一抗作陰性對(duì)照，用已知的陽性切片作為陽性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 Skp2和p27蛋白免疫組織化學(xué)染色陽性反應(yīng)為棕黃色和(或)棕褐色顆粒，Skp2定位于細(xì)胞核或細(xì)胞漿上，p27蛋白主要定位于細(xì)胞核上。每張切片選取10個(gè)高倍視野(×400)觀察陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比，無陽性細(xì)胞者為陰性(－)，＜50%細(xì)胞著黃色或者＜30%細(xì)胞著棕黃色者為陽性(+)，＞50%細(xì)胞著黃色或者＞30%細(xì)胞著棕黃色者為強(qiáng)陽性(++)。染色陽性及強(qiáng)陽性合并為染色陽性組，與染色陰性組比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果 Skp2蛋白染色主要表達(dá)于細(xì)胞核或細(xì)胞漿內(nèi)。Skp2蛋白在骨肉瘤中陽性表達(dá)率為74.3%(26/35);而在骨軟骨瘤中陽性表達(dá)率為11.4%(4/14)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.803，P=0.003)。見表1。p27蛋白染色主要表達(dá)于細(xì)胞核上。p27蛋白在骨肉瘤中陽性表達(dá)率為40.0%(14/35);而在骨軟骨瘤中陽性表達(dá)率為78.6%(11/14)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.954，P=0.015)。見表2。

表1 Skp2蛋白在骨肉瘤和骨軟骨瘤組織中的表達(dá) 例

表2 p27蛋白在骨肉瘤和骨軟骨瘤組織中的表達(dá) 例

2.2 Skp2和p27表達(dá)與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系 Skp2蛋白在骨肉瘤組織中的表達(dá)與Enneking分期、肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P ＜0.05)，而與性別、年齡無關(guān)(P ＞0.05);Skp2蛋白在骨肉瘤組Enneking外科分期Ⅱa、Ⅱb、Ⅲ期陽性表達(dá)率分別為60.0%、66.7%、91.7%，Ⅲ期骨肉瘤的 Skp2 蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與Ⅱa期、Ⅱb期相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而Ⅱa期與Ⅱb期的骨肉瘤的Skp2蛋白的表達(dá)強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。p27蛋白在骨肉瘤組織中的表達(dá)與Enneking分期密切相關(guān)(P＜0.05)，而與性別、年齡、肺轉(zhuǎn)移無關(guān)(P ＞0.05);p27蛋白在骨肉瘤組 Enneking外科分期Ⅱa、Ⅱb、Ⅲ期陽性表達(dá)率分別為60.0%、50.0%、16.7%，Ⅲ期骨肉瘤的 p27蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與Ⅱa期、Ⅱb期相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而Ⅱa期與Ⅱb期的骨肉瘤的Skp2蛋白的表達(dá)強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

2.3 Skp2和p27在骨肉瘤中表達(dá)的相關(guān)性 在35例骨肉瘤標(biāo)本中有7例(20%)Skp2和p27的表達(dá)同時(shí)呈陽性，2例(5.7%)同時(shí)呈陰性;26例(74.3%)Skp2和p27的表達(dá)呈不一致性。Skp2和p27在大腸癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－0.454，P=0.006) 。見表 4。

3 討論

Skp2基因是1995年由Zhang等［1］通過熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)的基因，其定位于人5號(hào)染色體短臂上(5p13)，分子量為45 kD。Skp2在許多細(xì)胞周期調(diào)控因子的泛素依賴性蛋白水解途徑中起到特異性識(shí)別底物的作用，從而參與細(xì)胞周期的調(diào)控。目前，已有許多細(xì)胞周期調(diào)控蛋白被證明通過Skp2依賴性泛素一蛋白酶途徑降解，其中包括cyclinDI、cyclinE、CDK抑制因子 p27，轉(zhuǎn)錄因子 E2F及 p53等。研究發(fā)現(xiàn)Skp2特異識(shí)別p27，通過泛素-蛋白酶體途徑降解p27［2］。在有絲分裂因子的刺激下，Skp2可下調(diào)P27，促進(jìn)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

表3 Skp2和p27表達(dá)與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系例(%)

表4 Skp2和p27在骨肉瘤中表達(dá)的相關(guān)性 例

p27基因(p27kip1)是1994年由Polyak等［3］首次發(fā)現(xiàn)的一種廣譜的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子，其定位于人染色體12p13，含兩個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子，cDNA長(zhǎng)594bp，編碼198個(gè)氨基酸。p27通過與CDK或Cyclin-CDK復(fù)合物的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)CDK活性的抑制，從而對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行負(fù)調(diào)控。p27主要抑制G1/S的關(guān)鍵酶的活性，使細(xì)胞增殖停止在G1期，對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)性調(diào)控作用，當(dāng)腫瘤細(xì)胞受到癌生長(zhǎng)信號(hào)刺激時(shí)，P27水平降低促進(jìn)G1期的進(jìn)展，增加細(xì)胞增殖的速度，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4］。

本研究顯示:Skp2在骨肉癌中呈高表達(dá)，其陽性率為(74.3%)，明顯高于骨軟骨瘤(11.4%)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。p27蛋白在骨肉瘤中陽性表達(dá)率為40.0%，而在骨軟骨瘤中陽性表達(dá)率為78.6%，且Skp2與P27表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P ＜0.05)。這與 Wang 等［5，6］的報(bào)道相一致，提示在腫瘤發(fā)生過程中，Skp2表達(dá)的上調(diào)可能通過泛素-蛋白酶體途徑導(dǎo)致P27表達(dá)減少，使其不能有效發(fā)揮細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子的抑癌作用，使癌細(xì)胞具有更高的侵襲轉(zhuǎn)移能力。本研究還發(fā)現(xiàn)Skp2蛋白在骨肉瘤組織中的表達(dá)與Enneking分期、肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，p27蛋白在骨肉瘤組織中的表達(dá)與Enneking分期密切相關(guān)，且臨床分期越高，Skp2的表達(dá)陽性率越高，而p27表達(dá)陽性率越低，這與Veillard等［7］的研究結(jié)果一致，表明Skp2和p27在腫瘤中的惡性轉(zhuǎn)化及癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中可能起重要作用。

1 Zhang H，Kobayashi R，Galaktionov K，et al.pl9Skpl and p45Skp2 are essential elements of the cyelin A － CDK2 Sphase kinase.Cell，1995，82:915-925.

2 Tsvetkov LM，Yeh KH，Lee SJ，et al.p27(Kip1)ubiquitination and degradation is regulated by the SCF(Skp2)complex through phospho-rylated Thr187 in p27.CurrBiol，1999，9:661-664.

3 Polyak K，Lee MH，Erdjument-Bromage H，et al.cloning of p27Kipl，a cyclin-dependent kinnse inhibitor and a potentialmedia tor of extmceIlular antimitogenic signals.cell，1994，78:59-66.

4 Slingerland J，Pagano M.Regulation of the CDK inhibitor P27 and its deregulation in cancers.JCell Physiol，2000，183:10-17.

5 Wang XC，Wu YP，Ye B，etal.Suppression of anoikis by SKP2 amplification and overexpression promotesmetastasis of esophageal squamous cell carcinoma.Mol Cancer Res，2009，7:12-22.

6 楊進(jìn)，尹邦良，徐朝軍，等.Skp2和P27在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)及其臨床意義.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10:4015-4018.

7 Veillard NR，Kwak B，Pelli G，et al.Antagonism of RANTES receptor reduces atherosclerotic plaque formation in mice.Circ Res，2004，94:253-261.