劉展 袁春麗 李青鳳 汪水城 王本旭

（1.北京市懷柔區(qū)婦幼保健院，北京 101400；2.北京軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 100042）

支原體肺炎是肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）引起的肺炎。支原體肺炎起病緩慢，患者有發(fā)熱、陣發(fā)性刺激性咳嗽、少量黏液性或黏液膿性痰。支原體肺炎多發(fā)于青少年，患病率占肺炎的15%～30%[1]。目前臨床治療支原體肺炎的常用藥物包括阿奇霉素、紅霉素等[2]。本研究旨在通過(guò)探討MP臨床分離株對(duì)臨床常用抗生素的敏感性，為臨床治療支原體肺炎提供用藥依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料 乳糖酸阿奇霉素（東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司，0.25 g，25萬(wàn) U／瓶），頭孢呋辛鈉（Esseti Farmaceutici s.r.l，Italy，0.75 g／瓶），頭孢曲松鈉（上海羅氏制藥有限公司，0.5 g／瓶），青霉素（石家莊制藥集團(tuán)有限公司，1 g／瓶）；美洛西林（華北制藥有限公司，1 g／瓶）；乳糖酸紅霉素（湖南中南科倫藥業(yè)有限公司，0.25 g／瓶）；支原體培養(yǎng)基CM0401、CM0403、SR0059和 SR0060C（Oxoid公司，United Kingdom）；核酸分子量標(biāo)準(zhǔn) DL2000 DNA Marker（大連寶生物工程有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 雙向培養(yǎng)基制備 100 mL蒸餾水中加入3.55 g CM0401，121℃高壓滅菌15 min，每個(gè)15 mL培養(yǎng)管中加入1 mL滅菌后的CM0401培養(yǎng)基，自然凝固。取1支SR0060C，加入20mL蒸餾水溶解。向每個(gè)培養(yǎng)管中加入2 mL SR0060C，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 咽拭子標(biāo)本選擇性培養(yǎng)與鑒定 將咽拭子標(biāo)本浸入雙向培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2周左右。當(dāng)培養(yǎng)基顏色由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)槌赛S色時(shí)，將培養(yǎng)液于MP固體培養(yǎng)（CM0403＋SR0059＋瓊脂粉）上劃板培養(yǎng)，直至鏡下看到“油煎蛋”樣菌落長(zhǎng)成為止。挑取菌落于雙相培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基顏色變化。

1.2.3 MP的PCR鑒定方法 支原體核酸提取方法參照 DNeasy Blood and Tissue Kit（Qiagen，Cat No：69504）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。引物參照文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)如下：上游引物為5’—GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3’；下 流 引 物 為 5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCT-3’。反 應(yīng) 條 件為94℃，5 min；94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，30 s；28個(gè)循環(huán)；72℃處理10 min。擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為280bp。以正常雙向培養(yǎng)基為陰性對(duì)照。

1.2.4 MP藥敏性實(shí)驗(yàn) 將MP分別與終濃度為5 mg／mL、1 mg／mL、100μg／mL、10μg／mL、5μg／mL和1μg／mL的阿奇霉素、紅霉素、頭孢呋辛鈉、頭孢曲松鈉、氨芐青霉素和美洛西林鈉共同培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基顏色的改變。待某2個(gè)濃度間培養(yǎng)基顏色出現(xiàn)變化后，進(jìn)一步稀釋至合適的藥物濃度。陰性對(duì)照不加任何抗生素。

2 結(jié) 果

經(jīng)過(guò)多輪特異的選擇性的雙相培養(yǎng)基篩選，成功分離到1株MP，該支原體能夠特異性地生長(zhǎng)在雙相培養(yǎng)基中，而且符合雙相培養(yǎng)基顏色變化。提取MP核酸，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，得到280 bp特異擴(kuò)增帶，與預(yù)期結(jié)果一致。見(jiàn)圖1。

圖1 MP的PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果

當(dāng)阿奇霉素、紅霉素、頭孢呋辛鈉終濃度分別稀釋至31μg／mL、125μg／mL、500μg／mL時(shí)，MP培養(yǎng)基顏色不變，隨著抗生素濃度降低，MP培養(yǎng)基顏色會(huì)逐漸由紅色變?yōu)槌赛S色。而頭孢曲松鈉、美洛西林鈉和氨芐青霉素在不同濃度下培養(yǎng)基顏色都由紅色變?yōu)槌赛S色。MP在不同濃度抗生素的雙相培養(yǎng)基中顏色的相對(duì)變化指示見(jiàn)表1。

表1 MP于不同濃度抗生素中培養(yǎng)基顏色變化情況

3 討 論

MP是介于細(xì)菌與病毒之間的一種微生物，是可獨(dú)立生活的最小生物個(gè)體，可吸附于呼吸道上皮細(xì)胞表面并破壞細(xì)胞表面，產(chǎn)生過(guò)氧化氫引起肺部組織損傷，引發(fā)一系列的病理免疫反應(yīng)[4]。關(guān)于臨床治療支原體肺炎時(shí)各種抗生素針對(duì)MP的有效抑制濃度，目前鮮有報(bào)告。

分離MP比較困難，主要原因之一是其生長(zhǎng)和增殖速度非常慢，在固體瓊脂培養(yǎng)板上需要生長(zhǎng)兩周以上才能在鏡下看到菌落。本研究采用Oxoid公司生產(chǎn)的對(duì)MP具有選擇性篩選作用的培養(yǎng)基進(jìn)行初步培養(yǎng)與篩選，然后通過(guò)支原體種屬特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，分離到了1株MP臨床株。

本研究顯示，阿奇霉素對(duì)MP的有效抑制濃度為31μg／mL，而紅霉素最低有效抑制濃度為125 μg／mL。這說(shuō)明該株MP對(duì)阿奇霉素較敏感，對(duì)紅霉素出現(xiàn)了一定的抗藥性，故臨床治療支原體肺炎時(shí)應(yīng)首選阿奇霉素，而非紅霉素。

本研究發(fā)現(xiàn)，頭孢呋辛鈉對(duì)MP具有一定的抑制作用，其最低抑制濃度為500μg／mL。本研究結(jié)果首次證實(shí)了頭孢呋辛鈉能夠有效抑制MP的生長(zhǎng)。但同為β－內(nèi)酰胺類抗生素的頭孢曲松鈉、美洛西林以及氨芐青霉素對(duì)MP生長(zhǎng)卻無(wú)抑制作用，其原因有待進(jìn)一步研究。

[1]陳玲玲，成云改，陳志敏，等.肺炎支原體肺炎患兒混合感染的研究[J].中華兒科雜志，50（3）：211-215.

[2]童海燕.重癥支原體肺炎56例治療分析[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)，2010，17（5）：661-662.

[3]李淳，吳移謀，朱翠明，等.PCR及RT-PCR檢測(cè)咽拭子標(biāo)本肺炎支原體的比較[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2012，28（2）：127-130.

[4]陳志敏.肺炎支原體肺炎的再認(rèn)識(shí)—從發(fā)病機(jī)制到臨床治療的探討[J].中國(guó)實(shí)用兒科雜志，2012，27（4）：253-257.