林海泓 羅心平 施海明 龔輝

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院心內(nèi)科，上海 201508；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200040）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植為治療心肌梗死提供了新思路，但是MSCs移植后的存活率低，使得歸巢到損傷心肌的干細(xì)胞數(shù)量甚少，這極大地影響了MSCs移植的臨床應(yīng)用效果[1]。

他汀類(lèi)藥物除具有降脂作用外，還具有促血管生成、改善內(nèi)皮功能障礙、抗氧化、抗炎等作用。近年來(lái)人們逐漸開(kāi)始關(guān)注他汀類(lèi)藥物與干細(xì)胞的關(guān)系。文獻(xiàn)[2－3]報(bào)告，他汀類(lèi)藥物可增加外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量，延緩其衰老，從而加快受損血管內(nèi)皮的修復(fù)，這可能是他汀類(lèi)藥物心臟保護(hù)作用的機(jī)制之一，據(jù)此推測(cè)其對(duì)MSCs也可能有類(lèi)似作用。本研究旨在探討普伐他汀在體外對(duì)H2O2誘導(dǎo)的人MSCs凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 低糖DMEM及胎牛血清購(gòu)自美國(guó) HyClone公司，0.25%胰酶和0.02%EDTA液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海華精生物高科技有限公司，普伐他汀購(gòu)自中美上海施貴寶制藥公司，細(xì)胞及組織總蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒及二抗購(gòu)自上?？党缮锕こ坦?，PI3K／Akt通路特異抑制劑Ly294002、ERK1／2通路特異抑制劑U0126、一抗AKT抗體、ERK1／2抗體及p38MAPK抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，p38MAPK通路特異激動(dòng)劑anisomycin購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 人MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 嚴(yán)格無(wú)菌條件下采集志愿者骨髓液5 mL，肝素抗凝，用孔徑為0.02 mm的輸血器過(guò)濾3次，加等量磷酸鹽緩沖液（PBS）混勻后，用1 mL針頭沿管壁慢慢注入淋巴細(xì)胞分離液，2000 r／min離心20 min。輕輕吸出中間白色云霧狀細(xì)胞層，加入PBS洗滌細(xì)胞，1000 r／min離心5 min，共洗3次。加入完全培養(yǎng)基后混勻，置于37℃5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。胰酶消化，1∶2傳代。取第6代細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表型檢測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將傳代后第4天的第6代MSCs用含0.5%血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h后，隨機(jī)分為5組。普伐他汀組換用含10μmol／L普伐他汀的完全培養(yǎng)基；對(duì)照組則始終用完全培養(yǎng)基；另3組分別用20μmol／L的Ly294002、20μmol／L的U0126以及10 mg／L的anisomycin預(yù)處理1 h后，換用含普伐他汀10μmol／L的完全培養(yǎng)基。1 h后所有組均用含1 mmol／L的H2O2的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。12 h后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 膜聯(lián)蛋白V／PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，消化并重懸為細(xì)胞懸液，收集于10 mL的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為（1～5）×106／mL，離心、洗滌細(xì)胞后用100μL的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10～15 min。再次離心、洗滌，加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃孵育20 min后，用流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司）檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞蛋白提取及 Western blotting檢測(cè) 按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用Stata 7.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 人MSCs細(xì)胞鑒定 用流式細(xì)胞儀對(duì)培養(yǎng)第6代的人MSCs進(jìn)行細(xì)胞表型分析顯示，細(xì)胞CD34表達(dá) （－），CD105（＋）、CD106（＋）。

2.2 普伐他汀對(duì) MSCs中PI3K／Akt、ERK1／2及p38MAPK通路的影響 普伐他汀可使人MSCs的PI3K／Akt通路磷酸化水平升高，2 h后作用仍持續(xù)；也可抑制p38MAPK通路磷酸化水平，抑制作用于30 min時(shí)達(dá)高峰。但是普伐他汀對(duì)人MSCs的ERK1／2通路和總Akt、總p38MAPK水平無(wú)顯著影響，見(jiàn)圖1～3。

2.3 人MSCs經(jīng)H2O2誘導(dǎo)凋亡后的形態(tài)檢測(cè) 未經(jīng)H2O2作用的MSCs貼壁生長(zhǎng)良好，邊界清楚，排列緊密，成纖維樣生長(zhǎng)，見(jiàn)圖4。細(xì)胞經(jīng)1 mmol／L H2O2作用12 h后，細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞內(nèi)顆粒及空泡增多，出現(xiàn)較多懸浮死亡細(xì)胞，有的細(xì)胞崩解為碎片，見(jiàn)圖5。經(jīng)普伐他汀預(yù)處理后再經(jīng)1 mmol／L H2O2處理的細(xì)胞，形態(tài)變化顯著輕于對(duì)照組，細(xì)胞形態(tài)基本保持不變，但細(xì)胞內(nèi)空泡較多，見(jiàn)圖6。普伐他?。獿y294002組細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖7。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)人MSCs經(jīng)H2O2誘導(dǎo)后的凋亡情況 普伐他汀組和普伐他汀＋anisomycin組均能對(duì)H2O2誘導(dǎo)的人MSCs凋亡起到顯著保護(hù)作用（P＜0.05），但普伐他汀＋Ly294002組無(wú)此保護(hù)作用，提示普伐他汀對(duì)人MSCs的凋亡保護(hù)作用可能與PI3K／Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)。見(jiàn)表1。

表1 藥物作用后對(duì)H2O2誘導(dǎo)的人MSCs凋亡的影響

3 討 論

研究[4]顯示，心肌梗死后行干細(xì)胞移植不論采取何種途徑，移植后的細(xì)胞僅有少量能最終到達(dá)心肌損傷部位并存活生長(zhǎng)，而大部分移植細(xì)胞在肺、肝等器官中被發(fā)現(xiàn)。另有研究[5]顯示，如果在急性心肌梗死后過(guò)早進(jìn)行干細(xì)胞移植，大部分移植細(xì)胞可能不能在缺血后的惡劣微環(huán)境中存活。因此，當(dāng)前干細(xì)胞移植面臨的一個(gè)重大挑戰(zhàn)就是如何保護(hù)移植細(xì)胞、改善細(xì)胞的存活率并促進(jìn)移植細(xì)胞在受損心肌組織內(nèi)分化生長(zhǎng)，以提高細(xì)胞移植效率。

本研究對(duì)體外培養(yǎng)的第6代人MSCs進(jìn)行細(xì)胞表型分析，發(fā)現(xiàn) CD34 （-），而 CD105（＋），CD106（＋），這符合MSCs表型特征。細(xì)胞對(duì)于外界刺激的反應(yīng)是通過(guò)信號(hào)之間的相互作用和交流進(jìn)行的，沒(méi)有任何一條通路在細(xì)胞的某種反應(yīng)中獨(dú)立存在，每條通路都和許多其他途徑相整合，它們的相互作用、整合的強(qiáng)度決定了細(xì)胞的命運(yùn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，PI3K／Akt通路的磷酸化水平在普伐他汀刺激后15 min即可升高，至2 h時(shí)作用仍持續(xù)；p38MAPK通路磷酸化水平則在普伐他汀刺激后受到抑制，抑制作用于30 min時(shí)達(dá)高峰，隨后減弱。這說(shuō)明普伐他汀可激活人MSCs的PI3K／Akt通路并抑制p38MAPK通路。由于本研究結(jié)果顯示普伐他汀對(duì)人MSCs的ERK1／2通路無(wú)顯著影響，故其后未進(jìn)行與此通路相關(guān)的凋亡實(shí)驗(yàn)。

移植到缺血的部位后大部分細(xì)胞可能因無(wú)法耐受缺血環(huán)境而發(fā)生凋亡，因此減少細(xì)胞凋亡可能會(huì)提高移植效率。文獻(xiàn)[6]報(bào)告，他汀類(lèi)藥物具有抗細(xì)胞凋亡作用，能夠保護(hù)多種細(xì)胞免受各種刺激誘導(dǎo)的凋亡。那么它對(duì)人MSCs的凋亡是否同樣具有保護(hù)作用？本研究顯示，普伐他汀可顯著地減輕細(xì)胞凋亡程度。而且我們發(fā)現(xiàn)，激活p38MAPK途徑后并不能影響藥物對(duì)H2O2誘導(dǎo)人MSCs凋亡的拮抗效應(yīng)。這一結(jié)果表明，p38MAPK途徑與普伐他汀介導(dǎo)的抗凋亡作用無(wú)關(guān)。當(dāng)用特異的PI3K／Akt通路抑制劑Ly294002阻斷PI3K／AKT信號(hào)途徑時(shí)，普伐他汀對(duì)人MSCs的保護(hù)作用受到抑制，提示PI3K／Akt通路的激活在普伐他汀對(duì)H2O2誘導(dǎo)人MSCs凋亡的抑制作用中起重要的調(diào)控作用。

本研究結(jié)果表明，普伐他汀對(duì)H2O2誘導(dǎo)的人MSCs凋亡有抑制作用。PI3K／Akt通路的激活參與了這種抗凋亡作用的調(diào)控。所以，普伐他汀在保護(hù)移植干細(xì)胞、改善干細(xì)胞的存活率并促進(jìn)移植干細(xì)胞在受損心肌組織內(nèi)生長(zhǎng)、提高干細(xì)胞移植效率等方面具有一定價(jià)值。

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