劉振威 李玉霞 方閱a 高風(fēng)英

（1.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院呼吸科，a藥劑科，上海 200080；2.上海市建工醫(yī)院呼吸科，上海 200083）

失血性休克時發(fā)生的急性肺損傷（acute lung injury，ALI）嚴重時可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），威脅患者的生命。目前，還原型谷胱甘肽已被廣泛用應(yīng)于心肌梗死、腦缺血和急性腦損傷等的治療[1]。但是，還原型谷胱甘肽對ALI是否具有保護作用，尚鮮見相關(guān)文獻報道。本研究通過建立失血性休克的大鼠模型，造成ALI，復(fù)蘇時應(yīng)用還原型谷胱甘肽，然后檢測大鼠動脈血漿中腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和肺組織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）含量以及支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中肺泡巨噬細胞（pulmonary alveolar macrophages，PAM）、中 性 粒 細 胞 （polymorphonuclear leukocytes，PMN）總數(shù)和蛋白質(zhì)含量，并觀察肺組織含水率、組織形態(tài)學(xué)等指標的變化，探討還原型谷胱甘肽對ALI的保護作用。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 取健康SD大鼠（復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動物中心）24只，體質(zhì)量（276.5±1.5）g，雌雄各半。

1.2 試劑與藥品 TNF-α測定試劑盒（中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室，批號20110113）；SOD測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20110108）；還原型谷胱甘肽（北京協(xié)和藥廠，批號20040223，每支600 mg）。

1.3 儀器 AXSYM全自動酶免分析儀（美國雅培公司）；AU640全自動生化分析儀（日本奧林帕斯公司）；SF23000全自動血球計數(shù)儀（日本東亞公司）；ML780型MacLab生理記錄儀（澳大利亞ADI公司）；DX51光學(xué)顯微鏡（日本奧林帕斯公司）；H27500透射電鏡（日本東芝株式會社）。

1.4 研究方法

1.4.1 失血性休克SD大鼠模型的建立 按照Wiggers改良法建立失血性休克模型[2]。通過三通接頭連接生理記錄儀，記錄平均動脈壓（MAP）和心率（HR）。

1.4.2 實驗分組 將24只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型對照組和研究組，每組8只，試驗前12 h禁食、禁飲。失血性休克后復(fù)蘇時，模型對照組靜脈滴注0.9%氯化鈉液，1.5 mL／kg；研究組靜脈滴注還原型谷胱甘肽，40 mg／kg；假手術(shù)組只進行手術(shù)操作，不建立休克模型，并靜脈滴注0.9%氯化鈉液，1.5 mL／kg。

1.5 觀察指標

1.5.1 TNF-α含量 于大鼠休克前、休克90 min、復(fù)蘇1 h末、復(fù)蘇3h末，分別經(jīng)股動脈取血1 mL，離心后分離血漿，－70℃保存，按照TNF-α測定試劑盒說明書操作。

1.5.2 BALF中PAM、PMN和蛋白含量 實驗結(jié)束即刻，迅速剖胸取左肺，用0～4℃0.9%氯化鈉液8 mL灌洗支氣管和肺，灌洗5次，并收集灌洗液。甲紫染色后計數(shù)BALF中吞噬細胞總數(shù)；用瑞氏液染色計數(shù)PAM和PMN，計算百分率，將百分率乘以細胞總數(shù)即得到細胞的絕對數(shù)。將BALF以1500 r／min離心5 min，取上清液用考馬斯亮蘭法測定其中蛋白含量。

1.5.3 SOD含量 取肺組織勻漿，按試劑盒說明書操作。

1.5.4 肺組織含水率 含水率＝（濕質(zhì)量－干質(zhì)量）／濕質(zhì)量×100%，計算肺組織的含水率。

1.5.5 形態(tài)學(xué)觀察 在光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。全部數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血漿TNF-α含量的變化 休克前3組大鼠TNF-α含量見表1。

2.2 BALF中細胞數(shù)量、蛋白含量的變化 見表2。

表1 3組血漿TNF－α含量比較（ng／L）

表2 3組BALF中細胞數(shù)量和蛋白含量比較

2.3 肺組織SOD含量、含水率的比較 見表3。

表3 3組復(fù)蘇后肺組織SOD含量和含水率比較（，n＝8）

表3 3組復(fù)蘇后肺組織SOD含量和含水率比較（，n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型對照組比較，b P＜0.01

組別 n SOD含量（nU／mg） 含水率（%）假手術(shù)組 8 7.37±0.38 70.23±1.90模型對照組 8 4.01±0.34a 79.45±0.99a研究組 8 6.35±0.12b 75.09±0.96b

2.4 肺組織形態(tài)學(xué)觀察 光鏡下可見假手術(shù)組肺組織的肺泡壁薄，相鄰肺泡僅隔以薄層間質(zhì)；模型對照組肺組織間質(zhì)增厚，粒細胞浸潤，部分區(qū)域呈肺不張狀態(tài)；研究組肺組織間質(zhì)增厚以及粒細胞浸潤的程度顯著輕于模型對照組。

3 討 論

Bhetia等[2]研究證實，體內(nèi) TNF－α水平的升高是失血性休克導(dǎo)致ALI的重要因素，而且其升高程度與ARDS的發(fā)生有一定的相關(guān)性。本研究顯示，SD大鼠失血性休克后血漿TNF－α含量持續(xù)升高，以復(fù)蘇后3 h最為明顯；應(yīng)用還原型谷胱甘肽后，血漿TNF-α升高幅度降低，提示還原型谷胱甘肽在一定程度上抑制了TNF－α的合成或釋放，進而對肺損傷起到保護作用。本研究中假手術(shù)組的TNF－α含量也出現(xiàn)小幅度上升，可能因手術(shù)操作使局部組織損傷所致。Bhatia等[2]研究認為，PMN在肺泡腔的大量積聚是ALI的特征性變化，檢測BALF中的PMN數(shù)量可以直接反映PMN浸潤的程度。肺毛細血管通透性增高是肺損傷后的基本病理改變，表現(xiàn)為血管中水和蛋白漏出血管壁，故測定BALF中的蛋白含量以及肺組織含水量可在一定程度上反映肺血管內(nèi)皮細胞的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)蘇后模型對照組、研究組肺組織BALF中PMN的數(shù)量、蛋白含量、含水率高于假手術(shù)組，表明失血性休克導(dǎo)致了肺水腫等ALI的表現(xiàn)，這與光鏡下觀察到的肺間質(zhì)增寬、粒細胞浸潤等組織學(xué)變化相符；還原型谷胱甘肽能夠顯著改善肺水腫。SOD可以清除氧自由基，保護細胞免受損傷。應(yīng)用氧自由基清除劑可以降低多器官功能衰竭的發(fā)生率[3－4]。測定SOD活力可反映組織抗氧化能力。本研究中，模型對照組肺組織中SOD活力較假手術(shù)組低，提示肺損傷過程中自由基清除不足，故組織細胞損傷較重。

綜上所述，還原型谷胱甘肽因能夠抑制ALI時血漿TNF-α含量的升高，減輕PMN浸潤，清除氧自由基，減輕肺組織水腫程度，從而對ALI起到有效的保護作用。

[1]Wu J，F(xiàn)errance JP，Landers JP，et al.Integration of a preco lumn fluorogenic reaction，separation，and detection of reduced glutathione[J].Anal Chem，2010，82（17）：7267-7273.

[2]Bhatia M，Zemans RL，Jeyaseelan S，et al.Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2012，46（5）：566-572.

[3]Alastair G，Proudfoot，Danny F，et al.Human models of acute lung injury[J].Dis Model Mech，2011，4（2）：145-153.

[4]Perl M，Lomas-Neira J，Venet F，et al.Pathogenesis of indirect（secondary）acute lung injury[J].Expert Rev Respir Med，2011，5（1）：115-126.