張瑞萍 徐冰心 王社論 鄭成中 董青 翟樹森 周學(xué)慧 高云閣

（解放軍第306醫(yī)院腫瘤科，a特種病科，b兒科，北京 100101）

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞是機(jī)體抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞。腫瘤患者體內(nèi)存在多種類型的免疫抑制細(xì)胞，其中CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）是對(duì)正向免疫應(yīng)答（包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞等參與的免疫應(yīng)答）起負(fù)向調(diào)控作用的CD4＋的T細(xì)胞亞群[1]。研究表明，腫瘤患者外周血中Treg細(xì)胞的數(shù)量增多，這提示Treg細(xì)胞的免疫抑制作用可能與實(shí)體瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[2－3]。分泌IFN-γ的CD4＋T細(xì)胞為 Th1細(xì)胞，分泌IL-4的CD4＋T細(xì)胞為Th2細(xì)胞。正常機(jī)體的Th1／Th2細(xì)胞處于動(dòng)態(tài)平衡，這對(duì)維持機(jī)體的免疫功能至關(guān)重要。本研究通過流式細(xì)胞儀檢測惡性腫瘤患者及健康人群外周血中的淋巴細(xì)胞亞群、Treg細(xì)胞數(shù)量以及Th1、Th2細(xì)胞，旨在了解惡性腫瘤患者的免疫狀態(tài)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2008年1月—2012年1月在解放軍第306醫(yī)院住院的經(jīng)病理明確診斷為惡性腫瘤的患者90例（腫瘤組），其中男性48例，女性42例；年齡35～83歲，中位年齡（52.2±3.5）歲；乳腺癌12例，肺癌26例，結(jié)直腸癌20例，頭頸癌5例，食管癌4例，婦科腫瘤9例，胃癌5例，腎癌5例，肝癌4例。腫瘤組患者在本研究前1個(gè)月均無化療、放療史，且近3個(gè)月未應(yīng)用免疫制劑，無發(fā)熱及輸血史。另選擇健康體檢者60例作為對(duì)照組，其中男性35例，女性25例；年齡30～78歲，中位年齡（50.4±5.6）歲。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 檢測外周血Treg細(xì)胞所需的試劑：小鼠抗人CD4-FITC單克隆抗體以及小鼠抗人CD25-APC單克隆抗體均購自美國BD公司，小鼠抗人 FoxP3-PE單克隆抗體、大鼠IG2α-PE、固定／破膜濃縮劑購自G-Biosciences公司。檢測T淋巴細(xì)胞內(nèi)Th1、Th2細(xì)胞因子所需的試劑：佛波酯（phorbol-12-myristate 13-acetate，PMA）、離 子 霉素、布雷菲得菌素（brefeldin-A，BFA）、小鼠抗人CD4-APC單克隆抗體、小鼠抗人IFN-γ／IL-4單克隆抗體、小鼠抗人γ2α-FITC單克隆抗體以及小鼠抗人γ1-PE單克隆抗體均購自美國BD公司。采用BD公司生產(chǎn)的Multi-test IMK四色免洗淋巴細(xì)胞亞群分析試劑盒檢測T淋巴細(xì)胞亞群，A劑為BD Multi-test CD3-FITC／CD8-PE／CD45PERP／CD4-APC，B劑為 BD Multi-test CD3-FITC／CD16PE＋56-PE／CD45P ERP／CD19-APC。

1.2.2 主要儀器 流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，CO2培養(yǎng)箱購自美國Forma scientific公司，離心機(jī)購自德國KENDRO公司，渦旋混勻器購自IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 淋巴細(xì)胞亞群檢測方法 用5 mL肝素鈉抗凝負(fù)壓真空采血管采集受試者空腹靜脈血2 mL，在4 h內(nèi)進(jìn)行檢測。配置溶血素備用。取兩個(gè)管，分別標(biāo)記為A、B管，各加入100μL全血，再分別加20μL A劑、B劑于A、B管中，混勻，室溫避光20 min。在A管、B管中均加入1000μL溶血素，混勻，室溫避光15 min后采用流式細(xì)胞儀檢測，軟件自動(dòng)分析得出結(jié)果。

1.3.2 T淋巴細(xì)胞內(nèi)IFN－γ、IL-4細(xì)胞因子的檢測方法 用肝素鈉抗凝管采集靜脈血2 mL，取500 μL全血，依次加入稀釋后PMA5μL（1μg／mL）、離子霉素1μL（1μg／mL）、BFA1μL（10μg／mL），然后置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，以刺激淋巴細(xì)胞。取200μL刺激后的血細(xì)胞加固定／破膜稀釋液（成分為 Triton X-100）1 mL，混勻后4℃避光放置30 min，然后離心，棄上清液。破膜后在各管中依次加入5μL CD4-APC抗體、小鼠抗人IFN-γ／IL-4單克隆抗體，而在同型管中加入相應(yīng)同型對(duì)照，各管均加20μL。低速渦旋混勻后，4℃避光放置30 min，隨后采用流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.3 外周血中Treg細(xì)胞的檢測方法 在實(shí)驗(yàn)管和同型對(duì)照管中各加入100μL外周全血，再加入20μL CD4-FITC以及5μL CD25-APC，混勻后室溫避光放置15～20 min，然后加入固定／破膜稀釋液1 mL，4℃避光放置30 min后，離心并棄上清液。在抗體管中加入5μL胞膜內(nèi)結(jié)合的免疫熒光Foxp3-PE抗體，在對(duì)照管中加入IgG2α抗體，避光放置30 min，然后用流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，驗(yàn)證兩樣本資料符合正態(tài)分布且方差齊性后采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤組及對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞亞群以及Treg細(xì)胞的分布 腫瘤組患者外周血CD3＋、CD4＋、NK細(xì)胞比例均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），而前者的Treg細(xì)胞比例則顯著高于后者（P＜0.05），驗(yàn)證兩組資料方差齊性后采用t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 腫瘤組及對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞亞群、Treg細(xì)胞的分布（，%）

表1 腫瘤組及對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞亞群、Treg細(xì)胞的分布（，%）

注：＊腫瘤組與對(duì)照組比較，P＜0.05

組別 n CD3＋T細(xì)胞＊ CD4＋T細(xì)胞＊ CD8＋T細(xì)胞 NK細(xì)胞＊ B細(xì)胞 Treg細(xì)胞＊腫瘤組 90 67.80±10.1234.21±10.0233.58±12.30 19.89±7.09 9.12±2.63 9.64±5.2107對(duì)照組 60 74.11±10.3239.02±11.0134.12±12.30 22.03±16.0811.21±6.32 3.65±1.

圖1 腫瘤組及對(duì)照組Treg細(xì)胞的表達(dá)

2.2 惡性腫 瘤患者外 周血IFN－γ／CD4＋、IL-4／CD4＋T細(xì)胞的數(shù)量 如表2所示，惡性腫瘤患者外周血IL-4／CD4＋T細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組，而IFN-γ／CD4＋T細(xì)胞數(shù)量顯著低于對(duì)照組，驗(yàn)證兩組資料方差齊性后采用t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 腫瘤組及對(duì)照組IFN－γ／CD4＋、IL-4／CD4＋的表達(dá)（，%）

表2 腫瘤組及對(duì)照組IFN－γ／CD4＋、IL-4／CD4＋的表達(dá)（，%）

組別 n IFN-γ／CD4＋ IL-4／CD4＋02對(duì)照組 60 13.89±2.13 2.03±0.28 P值 P＜0.05 P＜0.腫瘤組 90 9.37±3.07 4.35±2.05

3 討 論

機(jī)體的免疫功能在抗腫瘤免疫應(yīng)答中起著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤患者外周血CD3＋T細(xì)胞、CD4＋T細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），而Treg細(xì)胞的比例顯著高于對(duì)照組，這表明惡性腫瘤患者的抗腫瘤免疫功能嚴(yán)重受損。

早在20世紀(jì)70年代初期，Gershon等[4]明確提出了抑制性T細(xì)胞的概念。1995年Sakaguchi等[5]的研究表明，IL-2受體的α鏈即CD25分子可作為抑制性T細(xì)胞的表型，并明確提出了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）的概念。此后，出現(xiàn)了Treg細(xì)胞的研究熱潮。Curiel等[6]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤局部Treg細(xì)胞數(shù)量顯著增多，且腫瘤局部Treg細(xì)胞的數(shù)量與腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)。腫瘤局部的Treg細(xì)胞主要通過4種機(jī)制抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞（如T細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）的功能：（1）通過Treg細(xì)胞表面的CTLA-4分子下調(diào)樹突狀細(xì)胞（DC）表面的重要的共刺激分子CD80／86，從而抑制DC的成熟和抗原呈遞功能，間接抑制T細(xì)胞的活化；（2）通過分泌穿孔素和顆粒酶，直接殺傷DC和T細(xì)胞；（3）通過分泌抑制性的細(xì)胞因子IL-10和 TGF-β，廣譜抑制抗原特異性T細(xì)胞、B細(xì)胞及抗原提呈細(xì)胞（APC）等；（4）通過干擾細(xì)胞代謝，影響效應(yīng)細(xì)胞的功能[7]。目前，腫瘤的免疫治療在腫瘤的綜合治療中發(fā)揮著越來越重要的作用，Treg細(xì)胞的深入研究為腫瘤免疫治療提供了新的思路。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者外周血Treg細(xì)胞數(shù)量較健康人顯著增多，說明腫瘤患者的抗腫瘤免疫功能處于抑制狀態(tài)。

腫瘤特異性的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答均需要Th的參與。Th1細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，而Th2細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫。Sharma等的[8]研究表明，Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ具有較強(qiáng)的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，IFN-γ可以誘導(dǎo)NK細(xì)胞，增強(qiáng)其抗腫瘤活性，抑制某些腫瘤的生長。如果機(jī)體Th1型細(xì)胞占優(yōu)勢，說明機(jī)體處于良好的抗腫瘤狀態(tài)。Th2細(xì)胞分泌的IL-4可促進(jìn)腫瘤組織產(chǎn)生IL-10，抑制APC的功能；IL-4還可通過抑制IL-12和IFN－γ的產(chǎn)生、抑制NK細(xì)胞的活化、減少腫瘤細(xì)胞抗原的表達(dá)等來抑制細(xì)胞免疫的抗腫瘤效應(yīng)。體內(nèi)Th1和Th2兩個(gè)細(xì)胞亞群相互作用，互相拮抗，維持著相關(guān)細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)平衡。而當(dāng)Th1和Th2兩個(gè)細(xì)胞亞群發(fā)生平衡失調(diào)，即所謂的Th1／Th2漂移，就會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能的紊亂。本研究采用流式細(xì)胞儀檢測 了 腫 瘤 患 者 外 周 血 中 IFN-γ／CD4＋、IL-4／CD4＋的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤患者存在顯著的Th1向Th2漂移，說明腫瘤患者的抗腫瘤免疫受到嚴(yán)重干擾。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤患者存在免疫功能紊亂，其外周血中抗腫瘤免疫細(xì)胞CD3＋T細(xì)胞、CD4＋T細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例均顯著低于健康人，而其外周血中的Treg細(xì)胞則較健康人顯著增多，且存在Th1向Th2漂移，三者的協(xié)同作用導(dǎo)致腫瘤患者的抗腫瘤功能減弱及免疫逃逸。如何清除或下調(diào)Treg細(xì)胞、維持免疫細(xì)胞的平衡以及促使Th2向Th1逆轉(zhuǎn)對(duì)重建機(jī)體的抗腫瘤免疫功能有重要的意義。

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