孫思 杜小文 徐劍煒a

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院急診科，a整形外科，上海 200032；2.浙江省金華市人民醫(yī)院泌尿外科，浙江 金華 321001）

骨髓基質(zhì)中的多能細(xì)胞能夠分化成為多種中胚層來源的間質(zhì)細(xì)胞，故被稱為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）。這些細(xì)胞在一定條件下可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌樣細(xì)胞，而且經(jīng)過20～30個培養(yǎng)周期，仍能保持多向分化的潛能[1－2]。

本試驗采用密度梯度離心和貼壁分離相結(jié)合的方法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，用形態(tài)學(xué)觀察和流式細(xì)胞儀鑒定其表面抗原特性；用5－氮雜胞苷（5-azacy tidine，Sigma）在體外作用于大鼠BMSCs，誘導(dǎo)其向肌樣細(xì)胞分化，最后通過免疫組化染色來鑒定這些細(xì)胞的蛋白表達(dá)；旨在探討體外誘導(dǎo)BMSCs向橫紋肌肌細(xì)胞分化的可行性，為干細(xì)胞在組織工程學(xué)的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本采集 選用1周齡SD大鼠，處死后置于75%乙醇中浸泡10 min。無菌條件下分離大鼠的四肢長骨，用1 mL注射器抽吸培養(yǎng)液（Dulbecco＇s modified Eagle＇s medium，DEME，Sigma），從骨髓腔內(nèi)沖出骨髓，將骨髓液注入Percoll細(xì)胞分離液試管中，890 g／min離心，取中間的單個核細(xì)胞懸浮層，再加入培養(yǎng)液2 mL制成單細(xì)胞懸液，再離心后棄去上清液，加入2 mL培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液。臺盼藍(lán)細(xì)胞計數(shù)后將單細(xì)胞懸液以1×105／mL的密度接種于直徑10 cm的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)（培養(yǎng)基含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清），置于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 接種后第2天更換培養(yǎng)基，去掉非貼壁細(xì)胞，以后每3 d換液1次。待5～10 d細(xì)胞生長融合達(dá)90%時，用0.25%的胰蛋白酶加2 g／L乙二胺四乙酸（EDTA）3 mL，消化細(xì)胞。然后將細(xì)胞以1∶3接種于直徑10 cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)，加入10 mL培養(yǎng)液，于37℃恒溫、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3 表型鑒定 取傳至P3代后的細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測熒光異硫氰酸鹽（fluoresceine isothiocyanate，F(xiàn)ITC）熒光標(biāo)記的 CD29、CD34、CD45、CD105細(xì)胞表面抗原。

1.4 誘導(dǎo)分化 將已長滿的P2代BMSCs用EDTA消化后，按1∶3重新接種于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清培養(yǎng)基的24孔板內(nèi)，接種3 d后換液，在新培養(yǎng)液中加入5－氮雜胞苷10μmol／L，作用24 h。24 h后棄去含5-氮雜胞苷的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，改用含5%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液1次。

1.5 免疫組化 1周及3周時分別取接種于24孔板內(nèi)的誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)蘇木精－伊紅（hematoxylin-eosin，HE）、結(jié)蛋白、α－橫紋肌動蛋白（α-sacromeric actin，α-SMA）染色，與未經(jīng)誘導(dǎo)的BMSCs比較，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及染色變化。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs細(xì)胞形態(tài)及生長情況 本實驗選用1周齡SD大鼠，此年齡大鼠四肢長骨中骨髓豐富，BMSCs含量高，1只胎鼠的四肢長骨骨髓原液可分離得到1×106～2×106個細(xì)胞，培養(yǎng)2 d后貼壁率約60%。細(xì)胞增殖迅速，5 d后即出現(xiàn)融合現(xiàn)象，培養(yǎng)5～10 d后，細(xì)胞生長融合達(dá)90%，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生較大變化，可見紡錘形和星形多突起樣生長，P0代第10天細(xì)胞的生長形態(tài)見圖1。此時可以進(jìn)行傳代擴增，經(jīng)蛋白酶消化后呈單個圓形細(xì)胞。長滿直徑10 cm培養(yǎng)皿后可得細(xì)胞量3×106～5×106個。傳到P5代后細(xì)胞仍然形態(tài)良好，生長速度未見明顯減慢，細(xì)胞的生長曲線見圖2。

2.2 流式細(xì)胞儀表型鑒定 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的細(xì)胞表面抗原CD29陽性率89.4%，CD105陽性率46.0%，CD34陽性率3.3%，CD45陽性率2.5%（陽性率由儀器自動判斷顯示，圖3）。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

2.3 5-氮雜胞苷誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞 5-氮雜胞苷誘導(dǎo)后繼續(xù)培養(yǎng)3周，部分細(xì)胞變?yōu)槎嘟切?，呈長梭形生長，胞膜清楚，無空泡，胞內(nèi)可見趨于融合的多核肌管樣細(xì)胞結(jié)構(gòu)，見圖4。

2.4 蛋白表達(dá) 未經(jīng)5－氮雜胞苷誘導(dǎo)的P3代BMSCs在培養(yǎng)15d時，結(jié)蛋白和α－SMA兩種蛋白幾乎不著色，見圖5-1；誘導(dǎo)后1周的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有2種蛋白染色，細(xì)胞核染深色，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)蛋白染色為淡藍(lán)色，α-SMA染色為褐色，見圖5-2；誘導(dǎo)后3周的細(xì)胞2種蛋白染色較1周時明顯增強，見圖5－3。

圖4 誘導(dǎo)后3周肌樣細(xì)胞形態(tài)（×10）

圖5 免疫組化結(jié)果（×40）

3 討 論

BMSCs細(xì)胞體積小、核大、胞漿少，細(xì)胞器不發(fā)達(dá)，從骨髓提取時需注意與骨髓基質(zhì)細(xì)胞（marrowderived stromal cells，MDSCs）的區(qū)分。BMSCs和MDSCs都起源于中胚層。MDSCs屬于骨髓造血系統(tǒng)細(xì)胞，有分化為造血細(xì)胞的潛能，但在自然情況下它無分化為造血細(xì)胞傾向。BMSCs并不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原，如前體細(xì)胞標(biāo)記抗原CD34、成熟造血細(xì)胞標(biāo)記抗原CD38、白細(xì)胞標(biāo)記抗原CD45、淋巴細(xì)胞表面抗原CD11a和單核巨噬細(xì)胞表面抗原CD14，而只表達(dá) CD29、CD44、CD105、CD166等基質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記，尤其是CD105和CD166被作為BMSCs的特征性標(biāo)志。本實驗分離得到的細(xì)胞CD29陽性率達(dá)89%，CD105陽性率達(dá)46%，而CD34陽性率只有3.3%，CD45陽性率2.5%，與相關(guān)文獻(xiàn)相近[3－4]，說明本研究獲取的細(xì)胞為純度較高的大鼠BMSCs。本實驗獲得的BMSCs表面的CD29和CD105陽性率有差異，可能來源于抗體孵育和測量時造成的部分失活而引起的實驗誤差，這是在合理范圍內(nèi)的。

5－氮雜胞苷是一種去甲基化藥物，推測其可能與調(diào)控肌樣細(xì)胞分化的特異啟動子基因上的阻截蛋白結(jié)合，使DNA的胞嘧啶去甲基化，最終激活啟動肌細(xì)胞定向分化的調(diào)控基因，誘導(dǎo)BMSCs向肌樣細(xì)胞分化。有實驗研究表明，BMSCs的誘導(dǎo)分化程度與5－氮雜胞苷濃度和作用時間有關(guān)，在10μmol／L作用24 h誘導(dǎo)作用最強[5]。5-氮雜胞苷濃度低、作用時間短時，誘導(dǎo)分化不明顯；濃度超過20 μmol／L和作用時間超過48 h，則可引起細(xì)胞死亡脫落。

本研究結(jié)果表明，未經(jīng)誘導(dǎo)的P3代BMSCs不表達(dá)結(jié)蛋白和α-SMA。經(jīng)5－氮雜胞苷誘導(dǎo)后培養(yǎng)的BMSCs分別進(jìn)行結(jié)蛋白和α-SMA免疫組織化學(xué)染色，1周時為弱陽性，3周時為陽性，表達(dá)逐漸增強，表明經(jīng)過誘導(dǎo)后的細(xì)胞已向肌樣細(xì)胞分化。TGF-β也能誘導(dǎo)BMSCs向肌細(xì)胞分化[6]。有研究認(rèn)為，5－氮雜胞苷誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的作用較強，而向平滑肌細(xì)胞的誘導(dǎo)作用較弱[7]。本實驗誘導(dǎo)得到的肌樣細(xì)胞表達(dá)的結(jié)蛋白和α-SMA在骨骼肌和平滑肌中也都有表達(dá)，所以較難將其定性。經(jīng)5-氮雜胞苷誘導(dǎo)后的BMSCs明顯表達(dá)肌樣特異性蛋白，說明干細(xì)胞具有定性分化能力，這種前體肌細(xì)胞經(jīng)外界環(huán)境再刺激后，可能分化出3種不同的肌細(xì)胞。

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