吳寒 袁岱岳 賈曉斌 錢飛 朱建偉

（1.南通大學附屬醫(yī)院普外科，江蘇 南通 226001；2.江蘇省南通市第一人民醫(yī)院普外科，江蘇 南通 226001）

侵襲偽足（invadopodia）的形成是癌細胞發(fā)生侵襲轉移的至關重要的條件之一，該過程有賴于皮層肌動蛋白（cortactin）的裝配作用。作為侵襲性偽足形成的重要調控者，Arp2／3 復合物 （Arp2／3 complex）的主要作用是促進肌動蛋白的聚合和延長，這是肌動蛋白裝配過程的主要限速步驟。雖然Wiskott-Aldrich綜合征蛋白（Wiskott-Aldrich Syn-drome protein，WASPs）是Arp2／3復合物最強的激活蛋白，但是cortactin亦可通過加強Arp2／3復合體和肌動蛋白母鏈結合的關鍵步驟，促進Arp2／3復合物介導的分支肌動蛋白的成核。

cortactin有4個主要的功能區(qū)，其中與Arp2／3復合物結合的氨基末端酸性區(qū)域（NTA）和與肌動蛋白結合的一段串聯的重復序列區(qū)域（ABR）需同時存在，才能參與Arp2／3復合物介導的分支肌動蛋白的裝配[1－2]。我們的前期研究已成功設計僅包含ABR但無NTA的重組cortactin質粒[3]。本研究將僅包含ABR的重組質粒，命名為EGFP／N2／ABR，將其轉染高侵襲性人大腸癌細胞株LoVo，期望通過靶向抑制肌動蛋白裝配而控制其所依賴的腫瘤細胞膜活動，抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移，同時觀察半乳糖凝集素（galectin-1）表達的變化。

1 資料與方法

1.1 材料 4～6周齡BALB／C裸小鼠36只，雌性，體質量（18.0±2.0）g，購自中科院上海實驗動物中心。人大腸癌細胞株LoVo購自中科院上海細胞所。大腸桿菌DH5α由實驗室自備。僅包含ABR的重組cortactin質粒由本課題組前期構建[3]。galectin-1抗體購自美國R＆D公司。Taq酶、限制性內切酶、T4連接酶、LipofectamineTM2000均購自美國Invitrogen公司。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料技術有限公司。胰蛋白胨、酵母提取物系美國Sigma公司產品。質粒抽提試劑盒系美國Axygen公司產品。膠回收試劑盒購自美國Watson公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 結腸癌LoVo細胞株用含10%小牛血清的DEME培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、CO2體積分數為5%。取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 轉染及穩(wěn)定株篩選 在轉染前1 d將生長良好、處于對數生長期的LoVo細胞以2×105／cm2接種于24孔培養(yǎng)板，待細胞融合度均達60%～75%時進行轉染。轉染的方法為：（1）配置溶液A 用DEME培養(yǎng)基稀釋3.2μLDNA（濃度為250 g／L的EGFP／N2／ABR）至50μL并輕柔混勻；（2）配置溶液B用DEME培養(yǎng)基稀釋LipofectamineTM2000（1∶25）至50μL并輕柔混勻，室溫下孵育5 min；（3）將上述兩種溶液輕柔混勻，室溫下孵育20 min；（4）將總體積為100μL的混合液加入培養(yǎng)孔中，輕柔混勻，在37℃孵箱中孵育4～6 h后更換為含10%小牛血清的DEME培養(yǎng)液；（5）轉染1 d后在激光共聚焦顯微鏡下觀察轉染效果；（6）轉染24 h后用含G418的篩選培養(yǎng)基進行篩選，構建穩(wěn)定表達外源基因的細胞株。G418篩選濃度為500 mg／L，該濃度可以使細胞在10 d內全部死亡。具體方法見參考文獻[3]。

1.4 抑制體內腫瘤轉移實驗 采用脾內注射法制備大腸癌肝轉移模型。將36只裸鼠隨機分為3組，每組12只，分別為未轉染重組質粒組（LoVo組）、轉染空質粒組和轉染重組質粒組（EGFP／N2／ABR組）。將各組待轉染的細胞調整細胞密度為2×106／mL。無菌條件下，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉裸鼠，取左腹部切口進腹，顯露脾臟，于脾臟上極以50μL微量注射器緩慢進針，注入癌細胞懸液0.3 mL。用75%乙醇浸濕的紗布局部壓迫并擦拭以殺滅可能存在的游離癌細胞。然后將脾臟置于原位，關腹。待裸鼠瀕臨死亡或自然死亡時，對其進行解剖。對8周后仍存活的小鼠，頸椎脫臼處死，剖腹觀察腫瘤轉移情況，比較裸鼠的生存期。為便于計測肝轉移瘤結節(jié)，將肝臟表面轉移瘤結節(jié)數量分為4級：0級0個；Ⅰ級1～5個；II級6～10個；III級＞50個或轉移瘤結節(jié)呈塊狀融合，彌漫生長。

1.5 腫瘤組織中galectin-1蛋白的檢測 按常規(guī)蛋白印跡方法進行。

1.6 統計學處理 用SPSS 13.0軟件進行統計分析。個變量以均數±標準差表示，各組間采用t檢驗，等級資料采用Mann-Whitney U檢驗，生存分析通過軟件繪制Kaplan-Meier生存曲線，并采用Wilcoxon檢驗（Gehan比分法）進行生存率的比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 轉染細胞結果鑒定 EGFP／N2自身帶有綠色熒光蛋白，在激光共聚焦顯微鏡下可見眾多綠色熒光，結合同視野光鏡下的細胞形態(tài)，證實熒光均來自細胞，證明轉染成功。

2.2 裸鼠生存期觀察 Kaplan-Meier生存分析顯示，LoVo組、空質粒組和EGFP／N2／ABR組裸鼠的中位生存時間分別為（30.00 ± 3.40）d、（32.00±2.27）d和 （48.0 ± 10.39）d。Wilcoxon檢驗（Gehan比分法）結果顯示，EGFP／N2／ABR組的生存率顯著高于LoVo組，差異有統計學意義（u＝10.78，u＝13.31，P＜0.05），LoVo組和空質粒組的差異無統計學意義（u＝0.10，P＞0.05）。

2.3 裸鼠肝臟轉移瘤結節(jié)的差異 發(fā)生肝轉移的裸鼠肝臟表面及切面均可見大小不等的灰黃色轉移灶，呈彌散分布，部分轉移瘤結節(jié)融合成塊。脾臟表面均可見二三個散在的直徑3 mm左右的瘤結節(jié)。HE染色顯示，肝臟轉移瘤組織癌細胞聚集成團，異形性明顯，胞質少，核大，核分裂像易見。脾臟種植瘤癌細胞形態(tài)與肝臟轉移瘤癌細胞形態(tài)相似，符合低分化腺癌的特征。見圖1。

圖1 裸鼠成瘤的肝臟和脾臟的病理切片

為了將肝臟轉移瘤結節(jié)量化，按數量和是否有融合分為4級，進行分級計數。結果顯示，EGFP／N2／ABR組肝臟表面的轉移瘤結節(jié)數少于LoVo組和空質粒組，差異有統計學意義（P＜0.05），LoVo組和空質粒組的差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1、圖2。

2.4 galectin-1蛋白的表達水平 蛋白印跡結果顯示，EGFP／N2／ABR組galectin-1蛋白的表達水平顯著低于LoVo組和空質粒組（P＜0.05）。LoVo組和空質粒組galectin-1蛋白的表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

表1 3組裸鼠肝臟表面轉移瘤結節(jié)的計數表

3 討 論

惡性腫瘤細胞的浸潤和轉移與其細胞內肌動蛋白細胞骨架的重構密切相關[4]。細胞骨架的改變影響癌細胞的運動和遷移，其中包括細胞膜的偽足樣伸展、膜流動性及細胞極性的變化等，是癌細胞侵襲轉移各步驟的共同特征，其中的一個顯著特點是癌細胞膜形成侵襲偽足[5－6]。癌細胞首先侵襲偽足插入細胞外基質，并在插入部位分泌蛋白酶降解周圍的基質，使癌細胞突破基質屏障向縱深侵犯，最終進入循環(huán)播散到其他組織和器官[6]。本研究發(fā)現，通過靶向抑制cortactin與Arp2／3復合物的結合，轉染重組EGFP／N2／ABR質粒組裸鼠肝臟表面的轉移瘤結節(jié)數較未轉染組顯著減少。這表明人為地阻斷肌動蛋白的裝配過程，可以下調侵襲突觸的產生，抑制腫瘤的轉移。

近來的研究[7]表明，腫瘤細胞表面糖蛋白通過與凝集素結合，調控著許多生物學進程。galectins有保守的糖結合域和折疊結構，其與細胞膜糖基化蛋白的N-聚糖結合，形成半乳凝素－聚糖網格（galectin-glycan lattice），從而傳導生物學信息，調控細胞功能[8]。目前已發(fā)現有多種galectins在固有免疫和適應性免疫中介導不同的免疫反應，并參與腫瘤的侵襲和轉移[9]。Wu等[10]發(fā)現，galectin-1通過重塑肌動蛋白細胞骨架促進口腔鱗狀細胞癌的浸潤和轉移。Saravanan等[11]敲除β-1、6-N-乙酰葡糖胺轉移酶Ⅴ后，發(fā)現外源性galectins通過與角膜上皮細胞表面N-聚糖結合而促進侵襲偽足的形成。galetin-1的表達似與腫瘤細胞板狀突觸和（或）帶狀突觸的數量相關，這表明其可能通過重塑肌動蛋白細胞骨架，促進腫瘤的轉移，但在結腸癌中鮮見類似的相關報道。本研究中，LoVo組中肺轉移結節(jié)的galectin-1的表達水平顯著高于EGFP／N2／ABR組。因此，可以認為galectin-1的表達可能與結腸癌細胞骨架的重建以及浸潤突觸的形成有關，其中的機制值得我們進一步探討。

隨著對結腸癌細胞骨架和細胞運動研究的進一步深入，闡明腫瘤異常糖基化對其影響的具體機制，可為腫瘤的早期診斷、預后及分子靶向治療提供新的依據。

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