劉琛 王斌 武多嬌 王春生

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心外科，＊實(shí)驗(yàn)研究中心，上海 200032）

心臟移植模型是器官移植實(shí)驗(yàn)研究中最常用的模型，1973年Corry等[1]首次建立小鼠心臟移植模型。之后Matsuura等[2]成功將Cuff技術(shù)運(yùn)用于小鼠頸部心臟移植模型，使手術(shù)難度大大降低。本研究借鑒Cuff技術(shù)，旨在建立BALB／c小鼠和C57BL／6小鼠頸部心臟移植模型，觀察移植心臟急性排斥反應(yīng)，為今后的移植免疫研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選用8～10周齡BALB／c小鼠和C57BL／6小鼠，體質(zhì)量約25 g，雄性，購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。分兩組進(jìn)行心臟移植試驗(yàn)，每組各20對(duì)小鼠。實(shí)驗(yàn)組的供受體分別為BALB／c小鼠和C57BL／6小鼠，對(duì)照組的供受體均為BALB／c小鼠。常規(guī)顯微手術(shù)器械購(gòu)自上海醫(yī)療器械廠，10倍雙人雙目顯微手術(shù)放大鏡（上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠SXP-1C型），9-0、10-0醫(yī)用無(wú)損傷血管縫線購(gòu)自上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司。

1.2 手術(shù)方法

1.2.1 受體的準(zhǔn)備 用1%的戊巴比妥鈉（50mg／kg）麻醉受體小鼠后，將其固定于簡(jiǎn)易手術(shù)臺(tái)。皮膚以安爾碘消毒后，采用右側(cè)頸部縱切口，上至下頜骨，下至鎖骨。切除下頜腺及部分胸鎖乳突肌，游離右側(cè)頸外靜脈，于頸淺靜脈分叉處結(jié)扎后，近心端用9-0縫線打活結(jié)暫時(shí)封閉血流，在近結(jié)扎端處切斷，用含50 U／mL肝素的0.9%氯化鈉溶液沖洗，安裝外徑0.8 mm、內(nèi)徑0.5 mm的Cuff，用10-0的縫線固定。盡可能游離頸總動(dòng)脈，于頸管內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處結(jié)扎后，近心端用血管夾阻斷血流，于結(jié)扎點(diǎn)的近心端切斷，50 U／mL肝素0.9%氯化鈉溶液沖洗，安裝外徑0.6 mm、內(nèi)徑0.4 mm的Cuff管，用10-0的縫線固定。

1.2.2 供體心臟的獲取與修整 供體小鼠用與受體小鼠相同的方法麻醉后固定于簡(jiǎn)易手術(shù)臺(tái)。皮膚以安爾碘消毒后，正中切口開(kāi)腹，顯露下腔靜脈，注入4℃含50 U／mL肝素的0.9%氯化鈉溶液1 mL后，沿雙側(cè)腋前線整塊切除胸前壁，將心臟連同胸腺組織和肺完整切取后，迅速置于4℃乳酸林格氏冰水混合物中。心臟完全停止跳動(dòng)后，分離胸腺組織和食管；完全游離主動(dòng)脈，在無(wú)名動(dòng)脈水平予以橫斷；游離肺動(dòng)脈至分叉處切斷；用9-0縫線結(jié)扎下腔靜脈、上腔靜脈及肺靜脈（盡量靠近心臟），并于遠(yuǎn)心端切除肺組織。

1.2.3 移植手術(shù) 將修整好的供體心臟置于受體的手術(shù)切口內(nèi)，表面覆蓋4℃0.9%氯化鈉液浸濕的紗布。先將供體心臟的主、肺動(dòng)脈套于受體已裝好Cuff管的頸外靜脈，用10-0的縫線固定，再將供體心臟的主動(dòng)脈套于受體已裝好Cuff管的頸總動(dòng)脈，用10-0的縫線固定。先后開(kāi)放頸外靜脈和頸總動(dòng)脈的血流，同時(shí)用預(yù)熱的0.9%氯化鈉溶液迅速?gòu)?fù)溫。血管開(kāi)放后，可見(jiàn)主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈及冠狀動(dòng)脈充盈，移植心臟顏色迅速由蒼白變?yōu)轷r紅，1 min左右心臟由纖顫轉(zhuǎn)為規(guī)律搏動(dòng)。待移植的心臟復(fù)跳穩(wěn)定后，將心尖朝向頭側(cè)擺正移植心位置，腹腔注射0.5 mL0.9%氯化鈉溶液，用5-0絲線連續(xù)縫合關(guān)閉切口。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 手術(shù)成功的標(biāo)準(zhǔn) 以移植心臟成功復(fù)跳，連續(xù)搏動(dòng)超過(guò)3 d為手術(shù)成功。

1.3.2 組織病理學(xué)分析 移植后第7天，在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組受體小鼠中隨機(jī)選取10只小鼠處死，取移植心臟標(biāo)本，保存在10%多聚甲醛中。將心臟組織用石蠟包埋、切片（切片厚度為4～8μm）、脫水、固定，用蘇木精－伊紅染色，進(jìn)行組織病理學(xué)分析。移植心臟排斥反應(yīng)分級(jí)參照1990年國(guó)際心肺移植協(xié)會(huì)心臟移植急性排斥反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.3.3 移植心臟存活時(shí)間的觀察 對(duì)于手術(shù)成功的受體小鼠，肉眼觀察及直接觸摸移植心臟均無(wú)搏動(dòng)時(shí)，判為急性排斥反應(yīng)終點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)移植心臟的存活期。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)值變量以表示，兩組比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 手術(shù)成功率 術(shù)后移植心臟復(fù)跳率達(dá)100%，實(shí)驗(yàn)組1只小鼠術(shù)后未蘇醒，可能與術(shù)中失血過(guò)多有關(guān)。對(duì)照組1只小鼠蘇醒后出血過(guò)多而死亡，另1只小鼠術(shù)后第2天移植心臟停跳。手術(shù)成功率達(dá)92.5%（37／40）。

2.2 術(shù)后第7天移植心臟組織病理學(xué)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組移植心臟可見(jiàn)心肌細(xì)胞間質(zhì)有大量淋巴、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，并有心肌水腫、溶解、壞死，急性排斥反應(yīng)等級(jí)為3.55±0.44；對(duì)照組移植心臟僅見(jiàn)間質(zhì)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)壞死改變，急性排斥反應(yīng)等級(jí)為0.40±0.32；兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組移植心臟組織的病理圖片見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組移植心臟的心肌組織病理學(xué)檢查（HE，×200）

2.3 兩組移植心臟存活時(shí)間比較 實(shí)驗(yàn)組剩余的9只小鼠移植心臟存活（8.22±0.67）d，對(duì)照組剩余的8只小鼠移植心臟存活＞100 d（見(jiàn)圖2），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 兩組移植心臟存活時(shí)間比較

3 討 論

小鼠頸部心臟移植較腹部心臟移植，操作簡(jiǎn)便、手術(shù)時(shí)間短；對(duì)小鼠的生理狀況影響小，小鼠術(shù)后存活率高，且便于觀察移植心臟搏動(dòng)情況。但小鼠頸部心臟移植對(duì)術(shù)者的吻合技術(shù)以及對(duì)設(shè)備要求較高，且易出現(xiàn)吻合口出血及血栓形成。將Cuff技術(shù)運(yùn)用于小鼠頸部心臟移植，手術(shù)難度大大降低，且出血明顯減少，易于保證術(shù)后吻合口的通暢。

BALB／c和C57BL／6小鼠是純系的同種小鼠，具有不同的主要組織相容性抗原（MHC-Ⅰ、Ⅱ），可應(yīng)用于同種排斥反應(yīng)的免疫學(xué)研究。BALB／c小鼠以 Th2型為主，C57BL／6 小鼠以 Th1型為主[4]。同種移植急性排斥反應(yīng)主要由Th1介導(dǎo)[5]。小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)模型的供受體分別為BALB／c和 C57BL／6[6]。

本研究中，我們對(duì)Cuff套管法稍作改進(jìn)，先進(jìn)行受體準(zhǔn)備，再獲取供體心臟，控制供體心臟的缺血時(shí)間在30 min以?xún)?nèi)；血管開(kāi)放后，移植心臟顏色迅速由蒼白變?yōu)轷r紅，1 min之內(nèi)移植心臟即可復(fù)跳，復(fù)跳率100%。由于頸外靜脈較短，且分支較多，我們創(chuàng)新性地對(duì)其用9-0縫線活結(jié)阻斷，而未使用血管夾，增大了手術(shù)操作范圍，提高了成功率。受體的動(dòng)靜脈套管完成后，分別將其套入供體心臟的主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈，第一個(gè)結(jié)打于結(jié)扎線遠(yuǎn)端，以防止血栓形成，第二個(gè)結(jié)打于結(jié)扎線近端，以防止結(jié)扎線脫落。

本研究中，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，術(shù)后8 d左右移植心臟停跳，心肌組織的病理學(xué)表現(xiàn)為大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞水腫或壞死，說(shuō)明小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)體外模型已成功建立。該模型操作簡(jiǎn)單，無(wú)需深厚的顯微外科功底，且重復(fù)性好，手術(shù)成功率高，值得推廣。

[1]Corry RJ，Winn HJ，Russell PS.Primarily vascularized allografts of hearts in mice.The role of H-2D，H-2K，and non-H-2 antigens in rejection [J].Transplantation，1973，16（4）：343-350.

[2]Matsuura A，Abe T，Yasuura K.Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique[J].Transplantation，1991，51（4）：896-898.

[3]Billingham ME，Cary NR，Hammond ME，et al.A working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of heart and lung rejection：Heart Rejection Study Group.The International Society for Heart Transplantation[J].Heart Transplant，1990，9（6）：587-593.

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[5]van Besouw NM，Daane CR，Vaessen LM，et al.Different patterns in donor-specific production of T-helper 1 and2 cytokines by cells infiltrating the rejecting cardiac allograft[J].J Heart Lung Transplant，1995，14（5）：816-823.

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