邵曉冬 張永國 陳江 林浩 郭曉鐘

（沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016）

新近的研究[1]提示，某些鉀離子通道（voltagegated potassium channels，KV）與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其中電壓門控鉀離子通道與腫瘤的關(guān)系已成為研究的熱點(diǎn)。人類eag相關(guān)基因（human ether-a-go-go-related gene，HERG）編 碼 的 HERG蛋白是延遲整流型鉀離子通道的α亞單位。國外已有研究[2]發(fā)現(xiàn)，HERG蛋白在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)。本研究旨在探討HERG蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集沈陽軍區(qū)總醫(yī)院2000年—2002年經(jīng)手術(shù)切除的45例原發(fā)性胃癌的組織標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁正常胃組織（距離胃癌組織手術(shù)切緣＞5 cm的胃組織）。45例患者中，男性26例，女性19例；年齡42～75歲；其中高分化腺癌13例，中分化腺癌14例，低分化腺癌18例；根據(jù)胃癌Borrmann大體分型：0型1例，Ⅰ型7例，Ⅱ型16例，Ⅲ型15例，Ⅳ型6例；26例患者有局部淋巴結(jié)浸潤(rùn)，所有患者的腫瘤均無遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟TNM標(biāo)準(zhǔn)分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期14例，Ⅲ期20例，Ⅳ期7例。

1.2 免疫組化染色（SP染色法） 所有標(biāo)本在10%多聚甲醛溶液中固定，脫水后以石蠟包埋、切片備用。組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇脫水；然后將切片置于3%過氧化氫室溫放置20 min；切片表面加10%正常兔血清封閉液后將其置于濕盒中，37°C放置20min；按1∶200在切片表面滴加羊抗人HERG多克隆抗體，然后置于濕盒中，4℃過夜；加生物素標(biāo)記的兔抗羊IgG，置于濕盒中，37℃放置30 min；滴加SP工作液，置于濕盒中，37℃放置30 min；3，3-四鹽酸二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，用自來水反復(fù)沖洗終止反應(yīng)；蘇木精襯染；梯度乙醇及二甲苯透明并封片。

1.3 組織染色結(jié)果判定 顯微鏡下觀察組織染色結(jié)果，分別根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)比率對(duì)組織染色賦值。染色強(qiáng)度：細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或（和）細(xì)胞核呈淡棕色為弱陽性（＋），呈棕色為陽性（＋＋），呈深棕色為強(qiáng)陽性（＋＋＋），無信號(hào)為陰性（－）。陽性細(xì)胞數(shù)比率得分：無陽性細(xì)胞為0分；陽性細(xì)胞數(shù)比率＜33%為0.33分；陽性細(xì)胞數(shù)比率33%～67%為0.67分；陽性細(xì)胞數(shù)比率67%～100%（1分）。然后根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)比率得分的乘積判定各標(biāo)本的染色指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用最小顯著差法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

免疫組化結(jié)果顯示，HERG蛋白在胃癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中有表達(dá)，而在正常的胃上皮細(xì)胞中不表達(dá)，見圖1。對(duì)胃癌組織中HERG蛋白的表達(dá)水平與胃癌患者的臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，HERG蛋白的表達(dá)水平與患者的年齡、性別和胃癌的Borrmann大體分型無顯著相關(guān)（P＞0.05）；HERG蛋白在低分化胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于在高分化和中分化胃癌組織的表達(dá)水平（P＜0.05）；III、IV 期（按國際抗癌聯(lián)盟 TNM分期）胃癌組織中HERG蛋白的染色強(qiáng)度顯著高于I、II期胃癌組織（P＜0.05）；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中HERG蛋白的表達(dá)水平顯著高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織（P＜0.05），見表1。

圖1 HERG蛋白在胃癌組織及癌旁正常胃組織中的表達(dá)

表1 45例胃癌患者組織中HERG蛋白與胃癌臨床、病理學(xué)特征之間關(guān)系

3 討 論

HERG基因篩選自人的海馬cDNA文庫，該基因定位于人的7號(hào)染色體長(zhǎng)臂，含16個(gè)外顯子，編碼含1159個(gè)氨基酸的多肽，分子量約127000。HERG通道非常特殊，其具有外向鉀離子通道家族的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（六次跨膜片段），但卻表現(xiàn)為內(nèi)向整流和細(xì)胞外鉀濃度依賴性等內(nèi)向整流鉀離子通道的特點(diǎn)[3]。HERG電流的特點(diǎn)：（1）依賴去極化的活化門控開放，快速使超極化依賴的通道失活，導(dǎo)致電導(dǎo)降低，產(chǎn)生內(nèi)向整流；（2）對(duì)III型抗心律失常藥物敏感；（3）增大電導(dǎo)的細(xì)胞外鉀濃度依賴性。

研究[4]發(fā)現(xiàn)，在包括小鼠和人的不同種系的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中都有HERG樣電流，這種電流的電壓門控特點(diǎn)為內(nèi)在的失活和活化，此特點(diǎn)使得該類通道能在神經(jīng)母細(xì)胞瘤靜息膜電位的中心范圍內(nèi)（約－40 mV）發(fā)揮功能。這種通道的門控特點(diǎn)與細(xì)胞周期的控制機(jī)制相關(guān)，即在非同步化的細(xì)胞中HERG樣電流的激活曲線變化很大，而在同步化處于G1期的細(xì)胞中這種變化則較小。

有研究[5]表明，HERG基因和 HERG蛋白在原發(fā)子宮內(nèi)膜癌中高度表達(dá)，而在正常和增生的子宮內(nèi)膜中不表達(dá)。在腫瘤細(xì)胞中，HERG樣電流有助于維持細(xì)胞去極化的靜息電位，這是腫瘤細(xì)胞的常見特征之一。在嗜鉻細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、垂體瘤和胰腺β－細(xì)胞瘤細(xì)胞中都可檢測(cè)到 HERG樣電流[6]。

Smith等[7]在3種白血病細(xì)胞中[T細(xì)胞淋巴母細(xì)胞白血病（CEM），慢性骨髓性白血病（K562）和組織細(xì)胞性白血?。║937）]均檢測(cè)到HERG電流，且發(fā)現(xiàn)電流強(qiáng)度與蛋白豐度相關(guān)；HERG電流在這些白血病細(xì)胞系的增殖中發(fā)揮作用；Smith等的研究還顯示，HERG基因在增殖的非癌性細(xì)胞（激活的扁桃體細(xì)胞、EB病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和干燥綜合征患者的細(xì)胞）中的表達(dá)并不高于正常細(xì)胞。Pillozzi等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，在正常的外周血單核細(xì)胞和循環(huán)中的CD34＋細(xì)胞中HERG基因無表達(dá)，然而當(dāng)CD34＋細(xì)胞被細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子激活進(jìn)入有絲分裂時(shí)，會(huì)出現(xiàn)HERG基因的快速表達(dá)。HERG樣電流在小鼠心臟中的表達(dá)呈現(xiàn)出一種明顯的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，在胎心細(xì)胞中HERG樣電流占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而在成熟的心肌細(xì)胞則喪失了優(yōu)勢(shì)；但是，當(dāng)成熟的心肌細(xì)胞去分化或癌變時(shí)，HERG樣電流則重新獲得其在鉀離子通道電流中的表達(dá)優(yōu)勢(shì)。同樣，在神經(jīng)嵴神經(jīng)元的發(fā)育過程中，HERG電流僅在神經(jīng)元發(fā)育的極早階段有瞬時(shí)的表達(dá)，而后即被內(nèi)向整流性鉀電流所取代[9]。上述現(xiàn)象與臨床常用的腫瘤標(biāo)志物（如甲胎蛋白和癌胚抗原）具有相似性，HERG蛋白具有成為診斷惡性腫瘤的標(biāo)志物的潛力。

本研究結(jié)果顯示，HERG蛋白定位于胃癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，HERG蛋白的表達(dá)水平與胃癌的組織分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，說明HERG有望成為可以預(yù)測(cè)胃癌患者預(yù)后的標(biāo)志物。Lastraioli等[10]發(fā)現(xiàn)，HERG通道的活性與多種結(jié)腸癌細(xì)胞系的侵襲能力有關(guān)，HERG蛋白的表達(dá)量與結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲表型相關(guān)。該報(bào)告與本研究結(jié)果均提示，HERG蛋白與胃腸道惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

[1]Inglis V，Karpinski E，Benishin C.Gamma-dendrotoxin blocks large conductance Ca2＋-activated K＋channels in neuroblastoma cells[J].Life Sci，2003，73（18）：2291-2305.

[2 ]Crociani O，Guasti L，Balzi M.Cell cycle-dependent expression of HERG1 and HERG1B isoforms in tumor cells[J].J Biol Chem，2003，278（5）：2947-2955.

[3]Trudeau MC，Warmke JW，Ganetzky B，et al.HERG，a human inward rectifier in the voltage-gated potassium channel family[J].Science，1995，269（5220）：92-95.

[4]Chiesa N，Rosati B，Arcangeli A，et al.A novel role for HERG potassium channels：spike frequency adaptation[J].J Physiol，1997，501（Pt 2）：313-318.

[5]Cherubini A，Taddei GL，Crociani O，et al.HERG potassium channels are more frequently expressed in human endometrial cancer as compared to non-cancerous endometrium[J].Br J Cancer，2000，83（12）：1722-1729.

[6]Bianchi L，Wible B，Arcangeli A，et al.herg encodes a K＋current highly conserved in tumors of different histogenesis：a selective advantage for cancer cells[J]？Cancer Res，1998，58（4）：815-822.

[7]Smith GA，Tsui HW，Newell EW.Functional up-regu lation of HERG K channels in neoplastic hematopoietic cells[J].J Biol Chem，2002，277（21）：18528-18534.

[8]Pillozzi S，Brizzi MF，Balzi M，et al.HERG potassium channels are constitutively expressed in primary human acute myeloid leukemias and regulate cell proliferation of normal and leukemic hemopoietic progenitors[J].Leukemia，2002，16（9）：1791-1798.

[9]Wang H，Zhang Y，Cao L，et al.HERG K＋ channel，a regulator of tumor cell apoptosis and proliferation[J].Cancer Res，2002，62（17）：4843-4848.

[10]Lastraioli E，Guasti L，Crociani O，et al.herg1 gene and HERG1 protein are overexpressed in colorectal cancers and regulate cell invasion of tumor cells[J].Cancer Res，2004，64（2）：606-611.