王 赟，王吉平，張春林＊，翟素珍

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物技術(shù)教研室，貴州貴陽550004；2.貴陽醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室，貴州貴陽550004）

昆蟲防御素（Defensin）術(shù)語最初用于Sarcophaga peregina和Phormia terranovae的兩個抗革蘭陽性菌抗菌肽，并因與哺乳動物噬菌細(xì)胞的一組抗菌肽序列相似而命名為防御素［1］。防御素作為天然免疫的效應(yīng)分子為生物抵御病原菌的感染提供有效的第一位的防護(hù)。其中，昆蟲防御素是昆蟲受到意外傷害或微生物感染時，在血淋巴或消化道中產(chǎn)生的一類抗菌肽。昆蟲防御素通過天然的免疫機(jī)制對免疫防御體系不完善的昆蟲起著重要的作用［2］。

蚊蟲在受到外來病原侵襲時，會激活其內(nèi)源的防御素基因的表達(dá)，從而起到防御的作用［3］。致倦庫蚊屬于昆蟲綱雙翅目，不僅對人及牲畜騷擾吸血，而且是多種疾病的傳播媒介，如日本腦炎、班氏絲蟲病，其幼蟲孳生于污染的水體，如糞坑、水坑、水溝等，攜帶病原體數(shù)量多，而自身卻并不生病，因而推測其體內(nèi)具有強(qiáng)大的防御系統(tǒng)。

本研究通過RT－PCR技術(shù)獲得了致倦庫蚊防御素基因全長編碼區(qū)，構(gòu)建含有致倦庫蚊防御素成熟肽段的重組表達(dá)質(zhì)粒p ET32a－DEF，并優(yōu)化表達(dá)菌的培養(yǎng)、誘導(dǎo)條件，以實(shí)現(xiàn)重組蛋白的高效表達(dá)，最后獲得了純化的重組蛋白，這為進(jìn)一步研究該蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動物 致倦庫蚊（貴陽株）于2010年采集于貴州貴陽，由貴陽醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室飼養(yǎng)繁殖。

1.1.2 菌種和質(zhì)粒 原核表達(dá)載體p ET32a（＋）及大腸埃希菌（Escherichia coli）Rosetta、DH5α由貴陽醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室保存，克隆載體p MD18－T購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 主要試劑 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和 Hin dⅢ、T4DNA連接酶、PCR TaqTM酶、蛋白質(zhì)Marker為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑Trizol，質(zhì)粒提取試劑盒為北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；第一鏈cDNA合成試劑盒為MBI公司產(chǎn)品；IPTG（isopropylthjo－β－D－galactoside，異丙基硫代－β－D－半乳糖苷）、氨芐青霉素、氯霉素為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；His－鎳蛋白純化套裝為北京天恩澤基因科技有限公司產(chǎn)品；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 致倦庫蚊防御素基因的獲取 以岡比亞按蚊防御素氨基酸序列（ABB00947）為探針，對致倦庫蚊EST序列庫進(jìn)行tBLASTn檢索，得到1條與之同源的序列。將此序列用ORF Finder查找開放閱讀框，并進(jìn)行Blast比對為潛在防御素編碼基因。

1.2.2 致倦庫蚊防御素基因的擴(kuò)增、克隆及鑒定根據(jù)比對獲得的致倦庫蚊防御素基因片段設(shè)計引物，上 游 Def F：5′－AGATGAACTCGCTTGGAA－3′，下游 Def R：5′－GGCCAAACAATATTTATTA－3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。采用Trizol法提取致倦庫蚊總RNA，用紫外分光計測定總RNA純度和濃度，cDNA第一鏈的合成按照Fermentas第一鏈合成試劑盒操作說明進(jìn)行。目的片段擴(kuò)增條件：94℃5 min；94℃1 min，50℃30 s，72℃1 min，30個循環(huán)；72℃5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，并與p MD－18T載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α；藍(lán)白斑篩選陽性克隆并經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為p MD－DEF。

1.2.3 致倦庫蚊防御素成熟肽基因片段的PCR擴(kuò)增 根據(jù)測序獲得的防御素基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計擴(kuò)增成熟肽序列的上下游引物。上游引物CQF為：5′－CGGGATCCTTCCCTCAGGAGTC－3′，下劃線為Bam HⅠ酶切位點(diǎn)；下游引 物CQR為：5′－CCCAAGCTTGTCAGTTTCGGCAGACGC－3′下劃線為Hin dⅢ酶切位點(diǎn)。預(yù)計擴(kuò)增長度為249 bp。以重組質(zhì)粒p MD－DEF為模版，PCR擴(kuò)增條件：94℃5 min；94℃1 min，60℃30 s，72℃1 min，30個循環(huán)；72℃5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒p ET32a－DEF的構(gòu)建及測序分別用Bam HⅠ和Hin dⅢ雙酶切p ET32a（＋）質(zhì)粒和防御素成熟肽基因片段。酶切產(chǎn)物經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。用T4 DNA連接酶將質(zhì)粒與目的基因片段連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)PCR初步篩選陽性克隆，再抽提重組質(zhì)粒用Bam HⅠ和Hin dⅢ雙酶切進(jìn)一步鑒定，最后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果正確的命名為p ET32a－DEF。

1.2.5 重組表達(dá)質(zhì)粒p ET32a－DEF在大腸埃希菌中的表達(dá) 分別將空載體p ET32a（＋）和重組質(zhì)粒p ET32a－DEF轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐青霉素（100μg／mL）、氯霉素（25μg／mL）的LB瓊脂培養(yǎng)平板上，次日挑單菌落接種于含氨芐青霉素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600 nm約為0.6時，加入終濃度為1 mmol／L IPTG誘導(dǎo)4 h后，按常規(guī)進(jìn)行SDS－PAGE檢測，分析目的蛋白表達(dá)情況。

1.2.6 重組菌株誘導(dǎo)條件的優(yōu)化方法 為了獲得大量重組蛋白，以含100μg／mL氨芐青霉素、25μg／mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基作為培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)的基本條件，對IPTG濃度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)溫度進(jìn)行了研究。

1.2.6.1 IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化 取過夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒的Rosetta菌，按1∶50稀釋到含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r／min振蕩培養(yǎng)至OD600在0.6左右，分別加入終濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol／L 的IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)4 h后取樣，12%SDS－PAGE電泳分析重組蛋白的表達(dá)情況。

1.2.6.2 誘導(dǎo)時間的優(yōu)化 取過夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒的Rosetta菌，按1∶50稀釋到含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃以180 r／min振蕩培養(yǎng)至OD600 nm在0.6左右，以上一步確定的最佳IPTG濃度進(jìn)行誘導(dǎo)，分別于誘導(dǎo)后0、1、2、3、4、5、6、7 h取樣，12%SDS－PAGE電泳分析重組蛋白的表達(dá)情況。

1.2.6.3 不同誘導(dǎo)溫度下重組蛋白表達(dá)形式的檢測 取過夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒的Rosetta菌，按1∶50稀釋到含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃以180 r／min振蕩培養(yǎng)至OD600在0.6左右，以前兩步確定的最佳IPTG濃度、最佳誘導(dǎo)時間，分別于20、25、30、37℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)結(jié)束后，離心收集菌體，菌體沉淀重懸于細(xì)菌裂解緩沖液（50 mmol／L Tris－HCl p H 8.0、1 mmol／L EDTA、0.1 mol／L NaCl）中，反復(fù)凍融3次，在冰浴中超聲碎菌（200W，超聲3 s，停4 s，重復(fù)99次）。12 000 r／min離心30 min，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS－PAGE電泳，分析重組蛋白的表達(dá)形式。

1.2.7 重組蛋白的純化 根據(jù)優(yōu)化的表達(dá)條件，對陽性克隆進(jìn)行大量的誘導(dǎo)表達(dá)。大量誘導(dǎo)表達(dá)后的產(chǎn)物經(jīng)4℃、12 000 r／min離心10 min后，用細(xì)胞裂解液重懸沉淀，反復(fù)3次凍融，并冰浴超聲裂解細(xì)菌，收集上清參照His－鎳蛋白純化套裝說明書進(jìn)行，SDS－PAGE電泳檢測純化的重組蛋白。

2 結(jié)果

2.1 致倦庫蚊防御素基因RT－PCR結(jié)果

致倦庫蚊總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以Def F和Def R為引物擴(kuò)增，獲得大小約300 bp的特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期大小相符（圖1）。測序結(jié)果去除兩端引物后獲得長318 bp片段，含有300 bp完整的開放閱讀框，編碼99個氨基酸，將此序列登陸Gen－Bank，登錄號為JQ799049。

2.2 致倦庫蚊防御素成熟肽基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

以陽性克隆p MD－DEF為模版，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，在250 bp處有一明亮的條帶，與預(yù)期擴(kuò)增長度相符（圖2）。

2.3 重組質(zhì)粒pET32a－DEF克隆菌的PCR鑒定

用p ET系列載體的通用T7F／R引物和擴(kuò)增致倦庫蚊防御素成熟肽片段的特異性引物CQF和CQR交叉驗(yàn)證選取的單菌落是否為陽性克隆，并判斷目的片段插入的方向是否正確。結(jié)果顯示，CQF和T7R擴(kuò)增產(chǎn)物片段約為350 bp，T7F和CQR擴(kuò)增片段約為750 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖3），初步證明所挑取菌落為陽性克隆，且目的基因插入載體中的方向正確。

2.4 重組質(zhì)粒p ET32a－DEF的雙酶切鑒定及測序

對空質(zhì)粒p ET32a（＋）和重組質(zhì)粒p ET32a－DEF分別用Bam HⅠ和Hin dⅢ進(jìn)行雙酶切，結(jié)果顯示p ET32a－DEF在250 bp出現(xiàn)了一條與PCR產(chǎn)物大小一致的條帶，在約6 000 bp處出現(xiàn)了與p ET32a（＋）雙酶切后大小一致的條帶（圖4），更進(jìn)一步判斷目的基因成功地與載體連接。測序結(jié)果顯示重組表達(dá)質(zhì)粒p ET32a－DEF構(gòu)建成功。

圖4 p ET32a－DEF重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.4 Identification of recombinant plasmid p ET32a－DEF by enzyme digestion

2.5 重組質(zhì)粒pET32a－DEF在大腸埃希菌中的表達(dá)

SDS－PAGE電泳圖可以看出（圖5），誘導(dǎo)后的菌體總蛋白比未誘導(dǎo)的菌體總蛋白在相對分子質(zhì)量約29 ku處可見特異性的蛋白條帶，比空載體誘導(dǎo)后表達(dá)的蛋白條帶大，與預(yù)期大小相符。

2.6 IPTG濃度對重組蛋白表達(dá)的影響

SDS－PAGE電泳結(jié)果顯示（圖6），IPTG濃度對重組蛋白的表達(dá)的影響不明顯，用較低濃度的IPTG（終濃度0.2 mmol／L）即可誘導(dǎo)目的蛋白的大量表達(dá)。

2.7 誘導(dǎo)時間對重組蛋白表達(dá)的影響

SDS－PAGE電泳結(jié)果顯示（圖7），以0.2 mmol／L IPTG濃度進(jìn)行誘導(dǎo)時，在4 h時表達(dá)量較高，繼續(xù)延長誘導(dǎo)時間重組蛋白表達(dá)量基本維持恒定，因而選用4 h為最終誘導(dǎo)時間。

2.8 誘導(dǎo)溫度對重組蛋白表達(dá)的影響

以0.2 mmol／L IPTG濃度分別在20、25、30、37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h后，收集菌體經(jīng)超聲破碎及離心分離上清和沉淀，SDS－PAGE電泳結(jié)果顯示（圖8），重組蛋白在不同溫度均存在于上清中。凝膠灰度掃描顯示，pET32a－DEF重組蛋白在37℃時上清中的表達(dá)量最高，占菌體總蛋白的18.3%。

2.9 重組蛋白的純化

以上述確定的最佳表達(dá)條件誘導(dǎo)pET32a－DEF重組蛋白大量表達(dá)，超聲裂解后將上清按照His– 鎳蛋白純化套裝說明進(jìn)行純化，SDS－PAGE結(jié)果顯示純化蛋白大小約為29 ku，與目的蛋白大小相符，證明蛋白純化成功（圖9）。

3 討論

昆蟲的免疫系統(tǒng)與高等動物相似，也包括阻止異物侵染的體壁、消化道等物理性屏障，體腔內(nèi)的細(xì)胞免疫和多種具有免疫功能的抗菌肽組成的體液免疫［4］。昆蟲防御素屬于富含半胱氨酸的抗菌肽，其主要抗革蘭陽性細(xì)菌，偶爾也有抗革蘭陰性細(xì)菌或真菌的報道［5］。在抗生素抗藥性日趨嚴(yán)重的情況下，昆蟲防御素極可能成為新的抗菌藥物來源。Seufi A M等［6］研究發(fā)現(xiàn)夜蛾防御素對革蘭陽性和革蘭陰性菌均有抑制作用。

致倦庫蚊是多種疾病的傳播媒介，如乙型腦炎、班氏絲蟲病，其幼蟲孳生于污染的水體，如糞坑、水坑、水溝等，攜帶病原體數(shù)量多，而自身卻并不生病，推測其體內(nèi)具有強(qiáng)大的防御系統(tǒng)。Kumar B等［7］就曾利用絲蟲感染和未感染的致倦庫蚊建立差減雜交庫，獲得了7個與致倦庫蚊免疫相關(guān)的基因，其中包括防御素基因的部分序列。因而我們認(rèn)為防御素是致倦庫蚊免疫系統(tǒng)中的重要成分，體外獲得重組致倦庫蚊防御素蛋白，有利于對其功能和作用機(jī)理的研究。

利用基因工程技術(shù)在大腸埃希菌中高水平表達(dá)外源基因，從而獲得大量異源蛋白，是現(xiàn)代分子生物學(xué)的巨大成就之一［8］。大腸埃希菌作為基因工程表達(dá)的首選宿主，具有生產(chǎn)周期短、成本低、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)［9］，能夠解決天然資源匱乏、分離純化困難、化學(xué)合成昂貴等問題［10］。

IPTG濃度對外源蛋白在大腸埃希菌中的表達(dá)有較大的影響，有時，較低濃度的IPTG即可誘導(dǎo)外源蛋白的大量表達(dá)［11］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示IPTG濃度為0.2 mmol／L時即可誘導(dǎo)pET32a－DEF的大量表達(dá)，并且增加IPTG的濃度，重組蛋白的表達(dá)量沒有提高，所以選用IPTG終濃度為0.2 mmol／L作為誘導(dǎo)該蛋白表達(dá)的最佳IPTG濃度。誘導(dǎo)時間也是影響外源蛋白表達(dá)的一個重要因素，隨著誘導(dǎo)時間的延長，外源蛋白表達(dá)量將會增加，但是到達(dá)一定時間后，外源蛋白表達(dá)量將趨于恒定，而雜蛋白的表達(dá)量會迅速增加［12］。本研究結(jié)果顯示當(dāng)誘導(dǎo)時間到達(dá)4 h后，目的蛋白的表達(dá)量較高，隨時間的推移，重組蛋白的表達(dá)量不再增加，因而選擇4 h為該蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)時間。有資料報道，通過低溫可以增加重組蛋白的可溶性表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的活性，使包涵體的比例下降［13－14］。本研究分別在20、25、30、37℃對重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)超聲破碎后分析蛋白的表達(dá)形式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白均存在于上清中，以可溶的形式存在，其中在37℃目的蛋白的表達(dá)量最高，因而選用37℃為致倦庫蚊防御素蛋白表達(dá)的最佳溫度。

綜上所述，本試驗(yàn)通過RT－PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得致倦庫蚊防御素基因全長編碼序列，成功構(gòu)建了致倦庫蚊防御素重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a－DEF，并對其在大腸埃希菌Rosetta中的表達(dá)條件——IPTG濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度進(jìn)行了優(yōu)化，獲得最佳表達(dá)條件為IPTG濃度0.2 mmol／L，誘導(dǎo)時間為4 h，誘導(dǎo)溫度為37℃。在此條件下大量誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，并經(jīng)His－Ni蛋白純化柱獲得純化的蛋白，為其功能及作用機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)。

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