孫遠征,王明明,衛(wèi)哲,馬俊

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院,哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學,哈爾濱 150040)

電針已成為戒毒的有效治療方法,中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)(MLDS)參與成癮機制,是與學習、記憶、情感及行為學相關的重要結構。藥物成癮可對成癮者的學習記憶能力造成一定損害[1]。研究證實 Ca2＋-CaM-CaMK信號轉導通路在嗎啡成癮中起到重要作用[2],本實驗采用水迷宮訓練來觀察電針對嗎啡戒斷大鼠學習記憶的改善,并從中腦VTA水平檢測CaMKⅡ的活性,深入研究電針抗嗎啡戒斷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)機制。

1 材料和方法

1.1 實驗對象與分組

雄性SD大鼠48只,體重(190±30)g,清潔級,由黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供,適應性喂養(yǎng) 1星期后隨機分組,分為生理鹽水對照組(對照組),嗎啡戒斷模型組(模型組),電針治療組(電針組),艾灸治療組(艾灸組),共4組,每組12只。

1.2 試劑和儀器

鹽酸嗎啡(沈陽第一制藥廠),鹽酸納洛酮(成都倍特藥業(yè)有限公司),戊二醛(上海生物工程有限公司),多聚甲醛(分析純,上海溶劑廠),免疫組化檢測試劑盒(PV-6001)(北京中杉金橋生物技術有限公司);KWD808Ⅱ脈沖治療儀,Morris水迷宮。

1.3 造模

參考相關文獻[3]進行造模,除對照組外,每組采用逐日遞增法連續(xù)5 d背部皮下注射嗎啡,建立嗎啡依賴大鼠模型,每日 2次(8 Am、4 Pm),每日劑量為 20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg、50 mg/kg。末次注射嗎啡后3 h腹腔注射納洛酮(3 mg/kg)快速戒斷,立即將大鼠置于 3000 mL大燒杯中,記錄 10 min內大鼠的濕狗樣抖動、站立、扭體、洗臉等次數(shù)以及齒顫、上瞼下垂、激惹和體重下降等不可數(shù)戒斷癥狀反應,戒斷癥狀反應參照 Maldonade[4]的方法,根據(jù)評分標準進行評分,與已建立的嗎啡戒斷大鼠模型標準比較,確定模型建立成功。

1.4 實驗處理

上述戒斷模型建立后次日進行處理,穴位按照林文注《實驗針灸學》[5]取大鼠百會、大椎,雙側腎俞、三陰交及足三里穴。

電針組給予大鼠捆綁固定,針刺上述穴位,連接電針治療儀,采用疏密波,頻率 2/100 Hz,連接足三里及三陰交,以大鼠的下肢輕微抖動為度,每次 15 min,每日1次,連續(xù)治療6 d。

其余三組在相同時間相同方法捆綁固定,艾灸組在上述穴位給予艾條灸法治療。

1.5 Morris水迷宮檢測大鼠學習記憶

參考相關文獻[6],水迷宮測試分為兩個階段,第一階段是從治療的第1、2日進行水迷宮定位航行訓練,每日4次,實驗前將大鼠置于站臺上適應10 s,隨機將大鼠從不同象限置入池內,登上站臺5 s后終止記錄,最長記錄 60 s,60 s內不能上臺的讓其登上站臺適應10 s,第3、4、5日開始測試,測量各組平臺逃避潛伏期以評判大鼠的空間學習能力;第二階段是治療第6日將平臺撤除進行空間探索實驗,將大鼠從遠離靶象限入水,記錄60 s內跨越平臺次數(shù)以評判大鼠的空間記憶能力。

1.6 CaMKⅡ含量的測定

實驗結束后每組大鼠立即麻醉,左心室插管灌入生理鹽水、4℃的 4%多聚甲醛灌注固定。斷頭取腦置于4%多聚甲醛中進一步固定,石蠟包埋后行VTA腦切片,片厚6 mm。采用免疫組化PV二步法,按照試劑盒步驟操作。最后采用圖像分析系統(tǒng)對切片進行攝片,測定VTA腦區(qū)CaMKⅡ的平均光密度,進行實驗分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,采用方差分析,P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠嗎啡戒斷癥狀評分比較

除對照組外,其余各組大鼠均出現(xiàn)濕狗樣抖動、站立、跳躍、洗臉、齒顫、上瞼下垂、激惹等癥狀,并伴有不同程度的體重下降。而對照組無明顯戒斷反應,與之比較,模型組、電針組及艾灸組有明顯戒斷反應(P＜0.01),表示大鼠嗎啡戒斷模型建立成功。詳見表1。

表1 各組大鼠嗎啡戒斷癥狀評分比較 (x ±s,分)

2.2 各組大鼠Morris水迷宮的測試結果比較

在定位航行實驗中,對照組、電針組及艾灸組的平均潛伏期與模型組比較明顯縮短(P＜0.01),提示其空間學習能力明顯改善;電針組和艾灸組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),提示電針組優(yōu)于艾灸組。詳見表2。

表2 各組大鼠平均潛伏期的比較 (x±s,s)

在空間探索實驗中,對照組和電針組與模型組比較,穿臺次數(shù)均顯著增加(P＜0.01),艾灸組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),電針組和艾灸組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),提示空間記憶改善,電針組療效明顯。詳見表3。

表3 各組大鼠總共穿臺次數(shù)的比較 (x ±s,次)

2.3 各組大鼠CaMKⅡ的免疫組化結果比較

對照組、電針組及艾灸組CaMKⅡ的平均光密度值均明顯高于模型組(P＜0.01),提示在治療后VTA腦區(qū)內 CaMKⅡ的活性明顯增加;電針組與艾灸組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),提示電針組優(yōu)于艾灸組。詳見表4。

表4 各組大鼠海馬區(qū)CaMKⅡ的含量比較 (x±s,mg/L)

3 討論

嗎啡成癮被認為與學習記憶有關,成癮本身是一種記憶的同時又影響另一種記憶過程[7]。曾燕等[1]證實電針對嗎啡戒斷后大鼠的學習記憶有明顯恢復作用,然而是通過什么機制來改善損害后學習記憶功能尚不十分清楚。本實驗通過建立嗎啡戒斷模型,給予電針治療、定位航行和空間探索訓練以及中腦VTA腦區(qū)的活性表達檢測。有研究證明在采用Morris水迷宮空間探索實驗中采用第1次從遠離靶象限入水的成績作為評價指標來檢測大鼠的空間記憶能力得到比較合理的結果[8]。

中醫(yī)學認為阿片類成癮機制是煙毒內蘊、各臟腑氣血陰陽失衡,主要與肝、腎、脾有關[9，10]。選取百會、大椎、腎俞、足三里、三陰交各穴共同調節(jié)各臟腑的陰陽平衡。MLDS是一種主要涉及多巴胺、阿片肽、CaMK等不同遞質及受體的系統(tǒng)。阿片類物質作用于該系統(tǒng),使其各功能和結構發(fā)生改變,導致用藥者產(chǎn)生強迫性用藥和渴求狀態(tài),因此認為成癮是一種慢性復發(fā)性腦病[11],針刺是一種有效的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的刺激形式,電針戒斷安全、可靠。研究證明2 Hz頻率電針可以促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)釋放腦啡肽,100 Hz頻率釋放強啡肽,CaMKⅡ是突觸后致密物的主要成分,長期給予嗎啡,中腦和海馬內 CaMKⅡ活性和激酶含量明顯下降[12],嗎啡成癮影響學習記憶可能是通過改變細胞內 Ca2＋濃度,降低依賴于 Ca2＋的 CaMKⅡ蛋白活性而損害記憶,有相關海馬內 Ca2＋-CaMK與嗎啡戒斷后學習記憶影響的研究,本實驗從中腦VTA水平觀察CaMKⅡ的含量表達與學習記憶的關系。

由于關于針灸對嗎啡戒斷大鼠學習記憶能力的研究尚處于初級階段,隨著研究的進展,可以在大樣本實驗研究的基礎上進一步闡明阿片類物質成癮的中樞機制,通過阻斷與成癮有關的學習記憶過程來治療成癮以及防止復吸提供可靠的理論基礎。

[1] 曾燕,梁勛廠,李熳,等.電針對嗎啡戒斷大鼠學習記憶及海馬 CA3區(qū)長時程增強損害的恢復作用[J].針刺研究,2004,29(4):245- 251.

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