孫 紅 梅, 張 星 星, 白 玉, 王 際 輝, 王 晗, 肖 珊, 葉 淑 紅

( 大連工業(yè)大學(xué) 遼寧省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

多糖在自然界高等植物、藻類、細(xì)菌及動(dòng)物體內(nèi)均存在,分布極廣,通常來(lái)源于植物和藻類的多糖較為普遍[1]。近年來(lái),微生物多糖由于其來(lái)源廣泛、不受季節(jié)及地域的限制,越來(lái)越受到人們的關(guān)注。微生物多糖按其存在形式可分為胞內(nèi)多糖、胞壁多糖和胞外多糖。海洋微生物由于其特殊的生活環(huán)境,導(dǎo)致其體內(nèi)多糖的合成過(guò)程與陸地生物有所不同,具有產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、功能獨(dú)特的新型活性胞外多糖的潛力。

抗氧化劑是一種重要的食品添加劑,它主要用于阻止或延緩油脂的自動(dòng)氧化,還可以防止食品在貯藏中因氧化而使?fàn)I養(yǎng)損壞、褐變、褪色等[2]。以天然抗氧化劑取代合成抗氧化劑是今后食品工業(yè)的發(fā)展趨勢(shì),開(kāi)發(fā)廣譜、高效、成本低廉的天然抗氧化劑將是抗氧化劑研究的重點(diǎn)。

近幾年來(lái),越來(lái)越多的研究表明許多生物多糖及復(fù)合物具有良好的抗氧化作用,能夠提高抗氧化酶活性并清除自由基,是一種天然抗氧化劑[3]。此外,一些多糖還具有抗衰老、抗腫瘤、抗輻射等作用。這些生理學(xué)功能雖然各自有著不同的代謝機(jī)理,但可能直接或間接與其抗氧化性有關(guān)。目前, 對(duì)植物多糖、海藻多糖和真菌多糖的研究較深入,而對(duì)于海洋來(lái)源的細(xì)菌胞外多糖的抗氧化性報(bào)道較少[4]。本研究利用海洋假單胞菌發(fā)酵,對(duì)其產(chǎn)生的胞外多糖的還原能力、清除羥自由基、清除DPPH自由基和清除超氧陰離子自由基做了初步研究,為天然抗氧化劑的研究和開(kāi)發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

1.1.1 材 料

海洋假單胞菌PT-8,深海海泥中篩選所得；

種子培養(yǎng)基:葡萄糖5 g,牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,水1 000 mL,121 ℃滅菌 20 min；

發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖25 g,牛肉膏25 g,氯化鈉55 g,K2HPO41 g,MgSO41 g,KH2PO40.5 g,MnSO40.5 g,水1 000 mL,pH 7.5,121 ℃滅菌 20 min。

1.1.2 試 劑

1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH),Sigma公司產(chǎn)品；番紅花紅、鄰苯三酚、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、三氯乙酸、過(guò)氧化氫、無(wú)水乙醇,均為分析純。

1.2 胞外多糖的制備

種子培養(yǎng)基內(nèi)接一環(huán)菌,30 ℃培養(yǎng)24 h →4%接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)48 h→發(fā)酵液離心(3 800 r/min,20 min),收集上清液→上清液加3倍體積95%乙醇→4 ℃冰箱沉降過(guò)夜→離心(4 000 r/min,10 min)→多糖沉淀加適量水溶解→Sevag法去蛋白3次→上清液加3倍體積95%乙醇→4 ℃冰箱沉降過(guò)夜→離心(4 000 r/min,10 min)→棄上清液后將沉淀溶于適量水透析→冷凍干燥得粗多糖。

用蒽酮硫酸法[5]測(cè)定多糖含量。

1.3 多糖還原力的測(cè)定

取不同濃度樣品溶液1.0 mL,加入磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH 6.6)和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL；50 ℃水浴保溫20 min,冷卻后加入2.5 mL 10%的TCA終止反應(yīng)；離心取上清液2.5 mL,加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液,靜置10 min,以去離子水作參比,測(cè)定700 nm的吸光度值,吸光度值越大表示還原力越強(qiáng)。以同樣濃度的維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照[6-7]。

1.4 多糖對(duì)羥自由基(·OH)的清除作用

取磷酸鹽緩沖溶液(0.15 mol/L,pH 7.4)1.0 mL、番紅花紅溶液(0.52 mg/mL)0.1 mL,0.1 mol/L EDTA Na2-Fe2+1.0 mL,加入樣品溶液7.0 mL,最后加入6%的過(guò)氧化氫溶液0.8 mL,混勻后于40 ℃水浴中保溫30 min,冷卻后在520 nm處測(cè)定吸光值(A1),空白組以等體積去離子水代替樣品溶液(A0),對(duì)照組以等體積去離子水代替樣品溶液和過(guò)氧化氫溶液(A2)。以同濃度維生素C代替多糖作對(duì)比試驗(yàn)[8-9]。

清除率=(A1-A0)/(A2-A0)×100%

1.5 多糖對(duì)DPPH自由基(DPPH·)的清除作用

1.6 多糖對(duì)超氧陰離子自由基(O2-·)的清除作用

取4.5 mL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH 8.2)于試管中,在25℃恒溫水浴中預(yù)熱20 min。加入不同濃度的樣品溶液0.1 mL,再加入0.4 mL在25℃恒溫水浴中早已預(yù)熱好的鄰苯三酚溶液(7 mmol/L)。搖勻,體系在25 ℃恒溫水浴精確反應(yīng)4 min,然后加入2滴濃鹽酸(10 mol/L) 終止反應(yīng),測(cè)溶液在320 nm處的吸光度[11-12]。

清除率=[1-(Ab-Ac)/Aa]×100%

式中,Aa為不加樣品、加入鄰苯三酚時(shí)的吸光度；Ab為加入樣品和鄰苯三酚時(shí)的吸光度；Ac為加入樣品而不加鄰苯三酚時(shí)的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 胞外多糖的純度

用450 mL發(fā)酵液制備胞外多糖,冷凍干燥后得粗多糖2.5 g,取0.1 g溶于100 mL水,即1 mg/mL 溶液。通過(guò)蒽酮比色法測(cè)定溶液中的多糖含量,得吸光度為0.720,代入回歸方程得多糖質(zhì)量濃度為0.698 mg/mL,因此粗多糖的純度為69.8%。

2.2 還原力的測(cè)定

還原力是抗氧化活力的一個(gè)重要指標(biāo)。測(cè)定PT-8胞外多糖的還原能力,與維生素C作對(duì)比,結(jié)果如圖1所示。

圖1 胞外多糖和維生素C的還原力

從圖1可以看出,多糖的還原能力雖然低于維生素C,但是也表現(xiàn)出了一定的還原能力,還原力和多糖質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)存在較明顯的線性關(guān)系。

2.3 多糖對(duì)羥自由基(·OH)的清除作用

實(shí)驗(yàn)利用Fenton反應(yīng),由于羥自由基可特異地使番紅的紅色褪色,根據(jù)褪色程度可評(píng)價(jià)對(duì)羥自由基的清除率。選用不同濃度的維生素C和多糖樣品,測(cè)定清除羥自由基的清除率和濃度的關(guān)系,用IC50表示當(dāng)清除率達(dá)到50%所需的樣品濃度,結(jié)果如表1所示。

表1 多糖和維生素C對(duì)羥自由基·OH的清除率

由表1可知,多糖對(duì)羥自由基的清除作用比較明顯,隨多糖濃度的增加而增加并存在一定的量效關(guān)系。當(dāng)清除率達(dá)到50%時(shí)所需的多糖和維生素C分別為0.161和0.312 mg/mL?？梢?jiàn)多糖對(duì)羥自由基的清除作用大于維生素C,清除率最高可達(dá)95.00%,具有較強(qiáng)的清除羥自由基的能力。

2.4 多糖對(duì)DPPH自由基(DPPH·)的清除作用

DPPH(1,1-二苯基苦基苯肼)是一種穩(wěn)定的自由基,在乙醇溶液中呈深紫色,由于DPPH有個(gè)單電子并在517 nm處有強(qiáng)的吸收,當(dāng)加入具有抑制作用的化合物后,由于其單電子配對(duì)而使其特征吸收逐漸消失,其褪色程度與吸收減弱程度呈定量關(guān)系,因此可評(píng)價(jià)抗氧化活性[13]。多糖和維生素C對(duì)DPPH自由基的清除作用結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 多糖和維生素C對(duì)DPPH自由基的清除作用

Fig.2 The scavenging of EPSs and VCto DPPH·

由圖2可得出,胞外多糖清除DPPH自由基的能力隨多糖濃度的增加而增大,清除效果和維生素C相比仍有差距。隨著多糖濃度的增大,DPPH自由基清除率逐漸減緩,但仍呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。EPS對(duì)除DPPH自由基的清除率隨劑量增大而升高,當(dāng)EPS質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL時(shí),清除率達(dá)36.45%。

2.5 多糖對(duì)超氧陰離子自由基(O2-·)的清除作用

選取不同濃度的胞外多糖和維生素C測(cè)定兩者對(duì)超氧陰離子自由基的清除率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 多糖和維生素C對(duì)超氧陰離子的清除率

由圖3可以看出,多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用隨胞外多糖質(zhì)量濃度的增加而增加,清除效果與多糖濃度呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。當(dāng)超氧陰離子自由基清除率達(dá)到50%時(shí)所需的胞外多糖和維生素C的質(zhì)量濃度分別為0.128和0.141 mg/mL,可見(jiàn)多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力優(yōu)于維生素C,具有較強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基的能力。

3 結(jié) 論

海洋假單胞菌PT-8所產(chǎn)生的胞外多糖具有一定的還原能力,對(duì)羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基都有一定的清除作用:表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除羥自由基能力,其IC50為0.161 mg/mL,清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了維生素C；多糖在0～0.2 mg/mL對(duì)超氧陰離子自由基清除率均隨質(zhì)量濃度增大呈現(xiàn)一定量效關(guān)系,高于0.2 mg/mL時(shí)其抗氧化能力較維生素C強(qiáng),表明其具有較高的清除超氧陰離子自由基能力。

自由基被稱為“萬(wàn)病之源”,能夠引起機(jī)體的損傷,而羥基自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基是最主要的形式。多糖作為天然化合物對(duì)3種自由基有明顯的清除作用,終止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)達(dá)到抗氧化的目的,從而停止、甚至逆轉(zhuǎn)某些由于過(guò)量自由基所導(dǎo)致的損傷。同時(shí),原料來(lái)源簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品綠色,因此海洋假單胞菌PT-8胞外多糖作為天然抗氧化劑有很好的開(kāi)發(fā)前景。

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