代蕾穎,胡 軍,呂 瑛

(北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司，北京 100176)

20世紀(jì)80年代末，起源于放射性雜交的熒光原位雜交 (FISH)技術(shù)開始建立。20多年來，這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)得到了長足的發(fā)展，大量商業(yè)化探針的出現(xiàn)更使其廣泛應(yīng)用于臨床診斷。隨著FISH新技術(shù)的出現(xiàn)，探針的種類也不斷增加，肽核酸探針就是其中一種。肽核酸(Peptide Nucleic Acid，PNA)是一類具有類多肽骨架的DNA類似物，它是不帶電荷的分子，避免了寡核苷酸與其靶序列結(jié)合時(shí)因電荷相互排斥所導(dǎo)致的雜交不穩(wěn)定性，且PNA與靶序列的結(jié)合不易受雜交液離子強(qiáng)度的影響，從而顯示出其極強(qiáng)的雜交優(yōu)勢，大大提高了檢測靈敏度[1]。PNA-FISH技術(shù)適用于多種標(biāo)本類型，特別是檔案標(biāo)本，如福爾馬林固定石蠟包埋的組織。

1 材料與方法

1.1 材料 福爾馬林固定石蠟包埋的組織，標(biāo)記熒光素的PNA探針。

1.2 方法 石蠟組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟后用0.2 mol/L HCL和20μg/ml蛋白酶去除組織自身熒光背景，經(jīng)過預(yù)處理的樣本加入標(biāo)記熒光素的PNA探針，蓋上蓋玻片，用封片膠封住邊緣，放于預(yù)熱到雜交溫度的濕盒內(nèi),置于培養(yǎng)箱內(nèi)雜交90分鐘。去掉蓋玻片，于預(yù)熱到雜交溫度的洗脫液中洗脫30分鐘。樣本自然晾干后加入含有DAPI的抗淬滅劑后，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

用PNA探針，對經(jīng)過預(yù)處理的石蠟組織切片不經(jīng)過高溫變性，只經(jīng)過90分鐘55℃雜交，探針可以透過細(xì)菌的細(xì)胞壁得到信號。通常石蠟組織切片通過常規(guī)染色后定位目標(biāo)區(qū)域，然后再在熒光顯微鏡下找到FISH玻片相對應(yīng)的目標(biāo)區(qū)域觀察。在觀察之前應(yīng)該先了解信號的理論分布區(qū)域、形態(tài)(如DNA處于細(xì)胞核內(nèi)，RNA 處于胞漿內(nèi)，微生物則有其固有形態(tài))。過于銳利的、不規(guī)則的熒光信號一般為雜質(zhì)。選擇多個觀察視野，條件允許的情況下對所有目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行觀察。

為得到更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究分別通過標(biāo)本制備、標(biāo)本預(yù)處理、雜交、洗脫和結(jié)果觀察，對PNA-FISH 在石蠟切片樣本中的應(yīng)用技術(shù)要點(diǎn)進(jìn)行探討并比較了PNA-FISH與普通的DNA-FISH在多個方面的不同，見附表。

附表 PNA-FISH與DNA-FISH的比較

3 討論

因肽核酸本身的特性，PNA-FISH與普通的DNAFISH相比具有敏感性高、特異性強(qiáng)、周期短、操作簡便、標(biāo)記的探針可長期保存等特點(diǎn)。通常PNA探針都是人工合成的短序列，對于重復(fù)序列如著絲粒特異性的alphoid DNA、簡單衛(wèi)星DNA 和Alu家族，PNA-FISH技術(shù)都是很好的選擇[2]。除此之外PNA探針相對更疏水，使得PNA可以在不破壞細(xì)胞形態(tài)的情況下更易擴(kuò)散透過細(xì)菌的細(xì)胞壁，所以特別適合檢測不能培養(yǎng)或生長緩慢的微生物。

據(jù)報(bào)道，超過10年的石蠟包埋組織都可以檢測RNA[3]從理論上說，長時(shí)間的石蠟組織只要保存得當(dāng)，都可以做FISH實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前將石蠟組織切片固定在涂有多聚甲醛或多聚賴氨酸的載玻片上，56℃過夜即可。

如果樣本固定不充分導(dǎo)致核酸降解，不管后期怎么優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，這例樣本均不能得到準(zhǔn)確完整的PNA-FISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所以臨床上取得的新鮮組織要立即用中性福爾馬林固定，固定時(shí)間一般為24小時(shí)- 48小時(shí)。較大的組織標(biāo)本要剖開，保證組織各個部分都充分固定，避免DNA和RNA被降解，這是做組織切片F(xiàn)ISH的前提條件。

石蠟組織切片在做PNA-FISH 前需要做脫蠟、蛋白酶消化去背景等步驟。因?yàn)楸旧鞵NA探針的穿透性強(qiáng)，所以預(yù)處理的主要目的是降低背景自發(fā)熒光和去除雜質(zhì)干擾信號。

二甲苯脫蠟前用烤片機(jī)65℃烤玻片使蠟熔化有利于完全脫蠟。有些實(shí)驗(yàn)室為了實(shí)驗(yàn)人員的安全使用二甲苯取代劑，按照產(chǎn)品說明處理后的石蠟組織切片也可以做PNAFISH。

通常組織切片用蛋白酶來降低背景熒光，提高信號強(qiáng)度。胃蛋白酶較為溫和，而蛋白酶K活性則要強(qiáng)的多。難消化的樣品可以用鹽酸和異硫氰酸鹽處理，從而破壞交聯(lián)的組蛋白鍵，提高隨后的酶消化效率。

優(yōu)化組織背景的酶消化處理?xiàng)l件對實(shí)驗(yàn)成功尤為重要消化不夠則自發(fā)熒光高，消化過度會減弱信號。所以在開展PNA-FISH實(shí)驗(yàn)前要對此種組織的石蠟切片做條件優(yōu)化，選擇合適的條件以供后面的批量化實(shí)驗(yàn)。

因?yàn)镻NA的無電荷骨架以及疏水特性，PNA探針有相對于DNA探針的更高的結(jié)合親和力和快速雜交動力學(xué)，不需要對雙鏈DNA進(jìn)行變性解鏈或打開RNA的高級結(jié)構(gòu)，只需要大約90分鐘較高溫度的雜交就可充分雜交。雜交溫度根據(jù)熔解溫度(Tm)的高低來確定，Tm值高，雜交溫度高;Tm值低，雜交溫度低。常見的PNA-FISH雜交溫度一般為55℃和60℃。

PNA是不帶電荷的中性分子，所以PNA-DNA(或RNA雜交形成的雙鏈結(jié)構(gòu)由于缺少電荷的排斥作用使解鏈溫度增加，從而提高了PNA-DNA(或RNA)雜交體的熱穩(wěn)定性[4]所以在較高的洗脫溫度下進(jìn)行洗脫，一般為雜交溫度下，浸泡30min，期間可以適當(dāng)震蕩玻片使洗滌更充分。

綜上所述，PNA-FISH雖然具有技術(shù)快速、準(zhǔn)確、操作簡便等特點(diǎn)，但是在組織石蠟切片樣本中還是應(yīng)該關(guān)注一下要點(diǎn):組織樣本的固定是基礎(chǔ)，組織酶消化是實(shí)驗(yàn)結(jié)果成敗的關(guān)鍵，選擇合適的雜交和洗脫溫度，盡量擴(kuò)大觀察視野。

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