熊興東 劉振杰 王君文 周中軍 劉新光 (廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 東莞 5808)

早老癥(Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome，HGPS)是一種由LMNA基因突變引起的核纖層蛋白病〔1〕。在HGPS患者中，由于核纖層蛋白A(LMNA)基因在其外顯子11的1 824位發(fā)生核苷酸替代(C→T)，盡管未造成氨基酸殘基的改變(G608G)，但產(chǎn)生了一個(gè)潛在的剪切位點(diǎn)，導(dǎo)致外顯子11的150nt被剪切，使得prelamin A的C末端50個(gè)氨基酸殘基被切除〔2〕。缺失的50個(gè)氨基酸殘基中包含一個(gè)內(nèi)切蛋白酶Zmpste24的剪切位點(diǎn)。Zmpste24是一種金屬蛋白酶，是在哺乳動(dòng)物組織中廣泛存在的多跨膜蛋白。Pendas等〔3〕在國(guó)際上首次制備Zmpste24缺失基因小鼠(Zmpste24-/-)，發(fā)現(xiàn)Zmpste24缺失的小鼠prelamin A加工成熟過(guò)程被阻斷，導(dǎo)致大量未加工的prelamin A堆積，而且Zmpste24-/-小鼠具有HGPS患者所表現(xiàn)出的很多典型性的早衰表型，如骨質(zhì)疏松、生長(zhǎng)延緩、脂肪營(yíng)養(yǎng)不良、脫發(fā)、出牙異常和早老性死亡。這提示異常堆積的prelamin A會(huì)引起早衰。最近研究還發(fā)現(xiàn)，正常人細(xì)胞也存在這種prelamin A堆積的現(xiàn)象，只是處于低水平的狀態(tài)，隨著年齡增加而呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢(shì)，提示早老癥與生理性衰老有著共同的細(xì)胞分子基礎(chǔ)〔4，5〕。細(xì)胞衰老本身是多因素的綜合結(jié)果，無(wú)論是何種途徑引起prelamin A的堆積，對(duì)細(xì)胞衰老的影響都可能通過(guò)其相互作用蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，尋找與衰老相關(guān)的prelamin A結(jié)合蛋白并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行研究對(duì)于探索衰老發(fā)生的機(jī)制顯得非常有必要。本課題組采用酵母雙雜交方法從人骨骼肌DNA文庫(kù)中篩選prelamin A相互作用蛋白，初步發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白MT-2A能與prelamin A結(jié)合。為了進(jìn)一步確證該蛋白質(zhì)與prelamin A的體內(nèi)外的相互作用，我們采用一對(duì)一的回復(fù)性驗(yàn)證、細(xì)胞內(nèi)共定位等方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，并初步探討金屬硫蛋白MT-2A與細(xì)胞早老的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 含有prelamin A全長(zhǎng)的酵母表達(dá)質(zhì)粒pG-BKT7-prelamin A、prelamin A與紅色熒光蛋白R(shí)FP融合表達(dá)載體pDsRed-prelamin A由廣東醫(yī)學(xué)院衰老研究所構(gòu)建。大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒載體pEGFP-N1由廣東醫(yī)學(xué)院衰老研究所保存。酵母AH109購(gòu)自 Clontech公司。HEK-293細(xì)胞和 HEK-293prelamin A細(xì)胞(表達(dá)不能被加工處理的prelamin A，細(xì)胞呈早老表型)由香港大學(xué)周中軍博士惠贈(zèng)〔6〕。Lipofectamine2000為Invitrogen公司產(chǎn)品，其他為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 pACT2-MT-2A質(zhì)粒的提取和純化 以A型核纖層蛋白前體prelamin A為誘餌蛋白進(jìn)行酵母雙雜交篩選人骨骼肌文庫(kù)獲得了含有pACT2-MT-2A質(zhì)粒的酵母，采用Hoffman裂解法〔7〕提取質(zhì)粒 DNA。

收集5 ml培養(yǎng)物中的酵母沉淀，加入0.2 ml酵母裂解液(pH 8.0 Tris-HCl100 mmol/L，EDTA 1.0 mmol/L，2%Triton-X-100，1%SDS)，0.2 ml酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)和 0.3 g 酸洗玻璃珠，劇烈振蕩2 min，離心后上清中的質(zhì)粒DNA用2.5倍體積無(wú)水乙醇沉淀，最后將DNA沉淀重懸于20 μl無(wú)菌的TE緩沖液中。

提取的質(zhì)粒DNA電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，在含有Amp的平板上長(zhǎng)出的克隆為含有單一pACT2-MT-2A質(zhì)粒的克隆，送上海生工生物工程公司測(cè)序，測(cè)序引物為pACT2載體上的通用引物。

1.3 酵母一對(duì)一回復(fù)性驗(yàn)證 純化的pACT2-MT-2A質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化含有pGBKT7-prelamin A的AH109酵母感受態(tài)，轉(zhuǎn)化混合物涂布于SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His四缺平板上，30℃培養(yǎng)3～5 d，經(jīng)β-半乳糖苷酶分析，觀察克隆是否顯示藍(lán)色。

1.4 重組載體pEGFP-MT-2A的構(gòu)建 以HEK-293的cDNA為模板擴(kuò)增得到的MT-2A PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切和膠回收純化，與同樣雙酶切和膠回收純化的載體pEGFP-N1連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，挑取重組轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定，得到重組質(zhì)粒pEGFP-MT-2A。

1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞和激光共聚焦顯微觀察 按4×104/孔密度接種HEK-293細(xì)胞至24孔板，板內(nèi)預(yù)先放置蓋玻片，培養(yǎng)24 h后玻片上細(xì)胞生長(zhǎng)至約70%匯合度，按Lipofectamine2000操作說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

0.4 μg重組質(zhì)粒pEGFP-MT-2A和0.4 μg pDsRed-LA 共轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h后取出玻片利用Leica TCS SP5激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察拍照。

1.6 RT-PCR 分別以HEK-293和HEK-293prelamin A細(xì)胞的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)MT-2A基因的mRNA表達(dá)水平。MT-2A的RT-PCR擴(kuò)增引物，MT-2A-F:CCGGAATTCATGGATCCCAACTGCTCCT;MT-2A-R:CCGCTCGAGTCA GGCGCAGCAGCTGCAC。β-actin的 RT-PCR 擴(kuò)增引物，β-actin-F:GCACTCTTCCAGCCTTCCTTC;β-actin-R:CTGTCACCTTCACCGTTCCA。

PCR按照標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系進(jìn)行，反應(yīng)條件如下:預(yù)變性:94℃2 min;變性:94℃ 30 s;退火:55℃ 30 s;延伸:72℃ 1 min，進(jìn)行28個(gè)循環(huán)后繼續(xù)在72℃延伸5 min。在RT-PCR反應(yīng)體系中，同一模板中同時(shí)加入目的基因引物和內(nèi)標(biāo)基因β-actin引物，比較兩者擴(kuò)增產(chǎn)物濃度。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。

通過(guò)Alpha Imager 2200凝膠成像儀灰度掃描后，使用AlphaEaseFC3.1.2軟件分析結(jié)果，采用Studentt統(tǒng)計(jì)MT-2A在HEK-293和HEK-293prelamin A細(xì)胞中的差異表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 MT-2A與prelamin A回復(fù)性驗(yàn)證的結(jié)果 將pACT2-MT-2A質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有pGBKT7-prelamin A的AH109酵母感受態(tài)，在SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His四缺平板上能夠生長(zhǎng)出正常的克隆，經(jīng)β-半乳糖苷酶分析顯示藍(lán)色(圖1)，證明MT-2A與prelamin A能夠在酵母細(xì)胞內(nèi)特異性相互作用。

2.2 MT-2A和prelamin A蛋白在細(xì)胞內(nèi)共定位 質(zhì)粒pEGFP-MT-2A和pDsRed-prelamin A分別帶有綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白標(biāo)簽，各取0.4 μg質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞后兩種熒光標(biāo)簽蛋白分別與MT-2A和prelamin A融合表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)prelamin A(紅色熒光)主要位于核膜，環(huán)狀分布于核周?chē)?MT-2A(綠色熒光)同樣分布于核膜的周?chē)?。MT-2A和prelamin A蛋白存在部分共定位 (黃色熒光，圖2)。

2.3 MT-2A在HEK-293和HEK-293prelamin A細(xì)胞中的表達(dá)差異 利用RT-PCR分析MT-2A在HEK-293和HEK-293prelamin A細(xì)胞中的表達(dá)差異，用AlphaEaseFC3.1.2軟件對(duì)各電泳片段進(jìn)行光密度掃描分析。圖3結(jié)果表明金屬硫蛋白MT-2A在早老表型的HEK-293prelamin A細(xì)胞中的表達(dá)量顯著低于HEK-293細(xì)胞(P＜0.01)。

圖1 MT-2A與prelamin A在酵母體內(nèi)的相互作用

圖2 MT-2A和prelamin A蛋白在HEK-293細(xì)胞內(nèi)共定位分析

圖3 RT-PCR分析MT-2A在HEK-293和HEK-293prelamin A細(xì)胞中的差異表達(dá)

3 討論

隨著我國(guó)人口老齡化的到來(lái)，有關(guān)衰老的研究顯得非常必要。細(xì)胞衰老是個(gè)復(fù)雜而漸進(jìn)的過(guò)程。它是指細(xì)胞在外在微環(huán)境變化或內(nèi)在特定基因表達(dá)與失活等因素作用下脫離細(xì)胞周期，并不可逆地喪失增殖能力后進(jìn)入的一種相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)〔8〕。對(duì)兒童早老癥(HGPS)的研究結(jié)果表明，prelamin A能否正常加工成熟與細(xì)胞正常衰老或者早老密切相關(guān)〔2～5〕。若prelamin A正常加工受阻，大量未加工的prelamin A堆積，會(huì)導(dǎo)致DNA損傷顯著增加，并且存在明顯的DNA修復(fù)缺陷，細(xì)胞基因組不穩(wěn)定和p53介導(dǎo)的信號(hào)途徑被激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞具有HGPS患者所表現(xiàn)出的早衰表型〔9〕，可見(jiàn)prelamin A的異常堆積與細(xì)胞衰老緊密相關(guān)。但無(wú)論是何種途徑引起prelamin A的堆積，對(duì)細(xì)胞衰老的影響都可能通過(guò)其相互作用蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)。

我們利用酵母雙雜交方法從人骨骼肌DNA文庫(kù)中篩選prelamin A結(jié)合蛋白，結(jié)果篩選到了一組相互作用蛋白，其中包括MT-2A。一對(duì)一回復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明MT-2A與prelamin A在酵母體內(nèi)相互作用。熒光共定位的結(jié)果也表明MT-2A與prelamin A在細(xì)胞內(nèi)相互作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與正常表型的HEK-293細(xì)胞相比，MT-2A在早老表型的HEK-293prelamin A細(xì)胞中顯著低表達(dá)，提示MT-2A與細(xì)胞早老密切相關(guān)。此外，由于HGPS患者中LMNA基因突變主要集中在prelamin A蛋白的C末端，我們課題組采用酵母雙雜交方法從人骨骼肌細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選prelamin A的C端特異性結(jié)合蛋白，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)MT-2A與prelamin A的C端特異性結(jié)合(另文發(fā)表)。

金屬硫蛋白(MT)是一類(lèi)廣泛存在于生物細(xì)胞內(nèi)的低分子質(zhì)量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白。研究表明MT不僅具有重金屬解毒，清除自由基，抗輻射，修復(fù)組織損傷以及調(diào)節(jié)微量元素等重要作用，還與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤耐藥密切相關(guān)〔10～13〕。哺乳動(dòng)物的MT根據(jù)等電點(diǎn)和氨基酸組成的不同可分為4種亞型，即MT-1、MT-2、MT-3和MT-4。人MT-2A富含巰基，由61個(gè)氨基酸殘基組成，其中有20個(gè)半胱氨酸。研究發(fā)現(xiàn)MT-2A在多種惡性腫瘤或者低分化的腫瘤中高表達(dá)，提示MT-2A與細(xì)胞的惡性增殖密切相關(guān)〔14〕。目前有關(guān)MT-2A與細(xì)胞衰老的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。而我們的結(jié)果表明，MT-2A可能作為一個(gè)新的prelamin A相互作用蛋白，參與細(xì)胞早老的發(fā)生。但其影響細(xì)胞衰老的具體分子機(jī)制仍有待深入研究。

1 Liu B，Zhou Z.Lamin A/C，laminopathies and premature ageing〔J〕.Histol Histopath，2008;23(6):747-63.

2 Eriksson M，Brown WT，Gordon LB，et al.Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson-Gilford progeria syndrome〔J〕.Nature，2003;423(6937):293-8.

3 Pendas AM，Zhou Z，Cadinanos J，et al.Defective prelamin A processing and muscular and adipocyte alterations in Zmpste24 metalloproteinase-deficient mice〔J〕.Nat Genet，2002;(31):94-9.

4 Scaffidi P，Misteli T.Lamin A-dependent nuclear defects in human aging〔J〕.Science，2006;312(5776):1059-63.

5 Ragnauth CD，Warren DT，Liu Y，et al.Prelamin A acts to accelerate smooth muscle cell senescence and is a novel biomarker of human vascular aging〔J〕.Circulation，2010;121(20):2200-10.

6 Krishnan V，Chow MZ，Wang Z，et al.Histone H4 lysine 16 hypoacetylation is associated with defective DNA repair and premature senescence in Zmpste24-deficient mice〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2011;108(30):12325-30.

7 Hoffman CS，Winston F.A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli〔J〕.Gene，1987;57(2-3):267-72.

8 Campisi J，Yaswen P.Aging and cancer cell biology〔J〕.Aging cell，2009;8(3):221-5.

9 Varela I，Cadinanos J，Pendas AM，et al.Accelerated ageing in mice deficient in Zmpste24 protease is linked to p53 signalling activation〔J〕.Nature，2005;437(7058):564-8.

10 Yamasaki M，Nomura T，Sato F，et al.Metallothionein is up-regulated under hypoxia and promotes the survival of human prostate cancer cells〔J〕.Oncol Rep，2007;18(5):1145-53.

11 Kwon CS，Kountouri AM，Mayer C，et al.Mononuclear cell metallothionein mRNA levels in human subjects with poor zinc nutrition〔J〕.Brit J Nutri，2007;97(2):247-54.

12 Kim HG，Kim JY，Han EH，et al.Metallothionein-2A overexpression increases the expression of matrix metalloproteinase-9 and invasion of breast cancer cells〔J〕.FEBS Lett，2011;585(2):421-8.

13 Reinecke F，Levanets O，Olivier Y，et al.Metallothionein isoform 2A expression is inducible and protects against ROS-mediated cell death in rotenone-treated HeLa cells〔J〕.Biochem J，2006;395(2):405-15.

14 Jin R，Chow VT，Tan PH，et al.Metallothionein 2A expression is associated with cell proliferation in breast cancer〔J〕.Carcinogenesis，2002;23(1):81-6.