黃國林，秦耀琮，王權(quán)勝，代波，陸海旺，賓彬，唐乾利

（1.廣西岑溪市中醫(yī)院，廣西 岑溪 543200 E－mail：htmgx＠163.com；2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；3.右江民族醫(yī)學院，廣西 百色 533000）

少弱精子癥發(fā)病率高，且有逐年增加趨勢。通過應(yīng)用續(xù)斷種子方治療少弱精子癥的臨床研究，我們發(fā)現(xiàn)續(xù)斷種子方在臨床中具有較好的療效。筆者通過建立少弱精子癥大鼠模型的實驗方法，同時設(shè)左卡尼汀口服溶液作陽性對照，觀察中藥續(xù)斷種子方對少弱精子癥模型大鼠的生精作用。

1 材料

1.1 實驗動物分組 實驗動物40只雄性大鼠，2月齡，體重200～250g。由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK桂2003－0003。采用隨機數(shù)字表法隨機分為正常組、模型組、續(xù)斷種子方組、左卡尼汀口服溶液組各10只。

1.2 藥品及試劑 續(xù)斷種子方（主要藥物組成：菟絲子15g、杜仲15g、續(xù)斷15g、骨碎補15g、女貞子15g、枸杞子15g、黨參15g、白術(shù)15g、淮山藥15g），采用單味中藥配方顆粒（免煎中藥，由江蘇省江陰市天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）；左卡尼汀口服溶液（由東北制藥總廠生產(chǎn)，批準文號：國藥準字H19990372）；奧硝唑（由西安博華制藥有限公司生產(chǎn)，批準文號：國藥準字H20010514）。

2 方法

2.1 造模及給藥 參考文獻［1］的造模方法，建立大鼠少弱精子癥動物模型，造模方法及給藥方法如下：所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始灌胃。正常組大鼠每天給予生理鹽水灌胃；模型組給予奧硝唑（ORN）［800mg／（kg·d）］；對照組大鼠每天給予ORN［800（mg／kg·d）］加左卡尼汀口服溶液［100mg／（kg·d）］；實驗組大鼠每天給予 ORN［800mg／（kg·d）］加續(xù)斷種子方配方顆粒［10g／（kg·d）］。左卡尼汀口服溶液、續(xù)斷種子方均溶于生理鹽水。以上藥物均為每日新鮮配制，當日使用。大鼠灌胃劑量為4ml／d，1次／天，連續(xù)4周，給藥4周后對各組大鼠進行指標測定。實驗自開始之日起，每周稱重1次，調(diào)整藥物用量，并觀察記錄大鼠的體形、毛色、步態(tài)、覓食及活動情況，以及大鼠有無死亡及其可能的原因。

2.2 標本采集 各組大鼠在末次給藥24h后，用20%烏拉坦（0.5ml／100g）麻醉后，取各組一半大鼠剪開下腹部，取一側(cè)附睪、睪丸，稱其重量并迅速置于盛有2ml預(yù)溫37℃的生理鹽水的平皿中剪碎，于37℃溫水浴中溫浴2min，大鼠精子充分游離，用MACRO精子計數(shù)板檢測精子濃度，并計算精子活動率。取大鼠另一側(cè)睪丸組織及附睪組織，保存在戊二醛中固定24h送做超微結(jié)構(gòu)檢查。模型組大鼠2只用于造模病理檢查后處死，續(xù)斷種子方組大鼠1只、左卡尼汀口服溶液組大鼠1只灌胃死亡。

2.3 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)處理使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，多組計量資料方差齊性時采用單因素方差分析、方差不齊時采用秩和檢驗。

3 結(jié)果

3.1 續(xù)斷種子方對模型大鼠精子密度及活動率的影響 大鼠附睪游離精子密度與活動率檢測結(jié)果顯示：與正常組相比，模型組精子密度與活動率均明顯低于正常組（P＜0.05）；與模型組相比，左卡尼汀口服溶液組、續(xù)斷種子方組精子密度與活動率明顯高于模型組（P＜0.05）；續(xù)斷種子方組精子密度與活動率都比左卡尼汀口服溶液組高（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠附睪游離精子密度及活動率比較 （±s）

表1 各組大鼠附睪游離精子密度及活動率比較 （±s）

注：與正常組比較，a：P＜0.05；與模型組比較，b：P＜0.05；與左卡尼汀組比較，c：P＜0.05

組別 n 精子密度（×106／ml）活動率（%）10 53.05±4.55 70.20±8.54模型組 8 35.34±4.22a40.04±7.05a左卡尼汀口服溶液組 9 47.14±4.87b 63.23±6.34b續(xù)斷種子方組 9 50.25±5.08bc 66.34±7.58正常組bc

3.2 大鼠附睪組織超微病理學改變 模型組附睪管壁變薄，管腔內(nèi)精子明顯減少，不能充滿管腔，排列紊亂，附睪管腔間間隙增大；續(xù)斷種子方組、左卡尼汀口服溶液組附睪管壁較厚，精子充滿管腔，排列較為規(guī)則，呈團簇樣，管腔間隙較緊密，均與正常組類似，見圖1～4。

圖1 模型組附睪管腔精子×20000，附睪管腔內(nèi)精子數(shù)量明顯減少

圖2 左卡尼汀組附睪管腔精子×20000，精子量正常，精子結(jié)構(gòu)基本完整

圖3 續(xù)斷種子方組附睪管腔精子×20000，精子量正常，精子結(jié)構(gòu)基本完整

圖4 模型組附睪上皮細胞及纖毛×20000

4 討論

奧硝唑（ornidazole，ORN）是第三代硝基咪唑類衍生物，具有良好的抗厭氧菌和抗原生質(zhì)（如滴蟲等）感染作用。動物實驗主要用于預(yù)防各種厭氧菌感染和其對雄性大鼠的生殖功能具有可逆性抑制作用。有學者［2］研究認為ORN對附睪中精子的作用，主要是干擾精子成熟和運動所必需的糖酵解酶，使精子獲取能量過程受阻，從而降低了精子的活動率與活力。ORN每日給藥量達到一定劑量［800mg／（kg·d）］時，與正常組相比，睪丸重量顯著減輕，生精小管內(nèi)的精子細胞明顯減少，管腔內(nèi)還可見大片脫落的各級生精細胞，甚至有2只大鼠在CASA鏡下未發(fā)現(xiàn)精子，而呈無精狀態(tài)。電鏡觀察到高劑量ORN［800mg／（kg·d）］可導致大鼠生精上皮紊亂，同一層面的細胞發(fā)育不同步，精子尾部線粒體鞘部分缺失，線粒體溢出，空泡化，內(nèi)部結(jié)構(gòu)崩解碎裂。本實驗參考龐雪冰等造模方法［1］應(yīng)用ORN對大鼠灌胃，4周后檢測大鼠附睪精子，發(fā)現(xiàn)精子活動率及精子密度顯著下降，證明少弱精子癥大鼠模型造模成功。

本實驗結(jié)果顯示，應(yīng)用800mg／（kg·d）ORN灌胃，模型組睪丸生精小管管腔內(nèi)可見脫落的各級生精細胞，附睪管腔中精子數(shù)目明顯減少，有較多的非精子細胞成分，而續(xù)斷種子方組、左卡尼汀口服溶液組均可見大量精子，睪丸、附睪未見明顯改變。由此得出，續(xù)斷種子方對大劑量ORN所致的少弱精子癥模型大鼠精子數(shù)目和活力下降具有良好的保護作用，考慮可能為續(xù)斷種子方可以修復附睪組織氧化損傷，維持精子發(fā)生與成熟的內(nèi)環(huán)境，保護睪丸的正常生精功能。

我們根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，反復實踐，形成了自己獨特的辨證論治體系，認為男性不育癥以腎虛為主，與肝、脾等臟有關(guān)，兼夾濕熱、肝郁、血瘀等，治療主張健脾益腎為根本大法，補腎又根據(jù)陰陽互根理論，張景岳曰：“善補陽者，必于陰中求陽，則陽得陰助而生化無窮；善補陰者，必于陽中求陰，則陰得陽升而泉源不竭”。論治需進行陰中求陽、陽中求陰。因久病、來自家庭的壓力，病人或多或少會出現(xiàn)心理問題，中醫(yī)稱之為肝郁，“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”故應(yīng)疏肝健脾，但一味疏肝會影響精子的活力，應(yīng)逐漸轉(zhuǎn)向健脾益腎法為主治療。所以，精子質(zhì)量低下所致的男性不育癥應(yīng)從調(diào)理脾腎入手，臨床上也以脾腎虧虛、氣血不足為多見。因此，我們確立了“脾腎兩虛”為現(xiàn)代男性不育癥的基本病理，并以此理論為指導組成中藥驗方續(xù)斷種子方治療男性不育之少弱精子癥。臨床觀察表明續(xù)斷種子方治療少弱精子癥具有較好效果，能顯著提高患者精子活力和活率［2，3］。

此外，劉友章教授提出“中醫(yī)脾－線粒體相關(guān)學說”，在研究中發(fā)現(xiàn)，六君子湯對受損傷的線粒體有保護作用，在進行國家“七五”攻關(guān)課題“脾虛證候機理研究”中，對脾虛證患者胃黏膜細胞線粒體變化進行電鏡觀察，報道了脾虛病人胃黏膜壁細胞線粒體數(shù)目減少、超微結(jié)構(gòu)受損、能量代謝障礙，提出了“中醫(yī)脾－線粒體相關(guān)學說”，提出中醫(yī)脾主運化，不僅僅是指食物在胃腸的消化吸收，更重要的是營養(yǎng)物質(zhì)在線粒體的生物氧化產(chǎn)能過程。線粒體幾乎存在于人體全身的組織細胞之中，是細胞對食物進行生物氧化產(chǎn)能的細胞器，有“ATP的生產(chǎn)基地”、“細胞的動力站”之稱。這與中醫(yī)“脾為氣血生化之源”、“后天之本”有著密切的聯(lián)系［4，5］。此外，有報道弱精子癥患者精子線粒體基因出現(xiàn)不同程度的異常［6］。結(jié)合本研究的實驗結(jié)果，我們推論，續(xù)斷種子方可能通過調(diào)控體內(nèi)抗氧化酶活性，提高生精細胞的氧化應(yīng)激損傷修復能力，維持精子發(fā)生發(fā)育過程中內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，提高生精細胞線粒體ATP的合成，維持睪丸附睪的超微結(jié)構(gòu)等而發(fā)揮多途徑、多靶點、多環(huán)節(jié)、多層次的綜合調(diào)控作用，從而提高機體本身的生育能力。

［1］ 龐雪冰，朱洋，李紅鋼，等.奧硝唑?qū)Υ笫缶拥挠绊懠白饔脵C制探討［J］.中華男科學雜志，2005，11（1）：26－28.

［2］ 王權(quán)勝，潘恩山.鄭澤棠教授辨證論治男性不育癥［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2009，12（11）：82－84.

［3］ 王權(quán)勝，賓彬，唐乾利，等.從“脾腎兩虛”論治少弱精子癥58例［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2012，39（5）：889－890.

［4］ 劉友章，王昌俊，周俊亮，等.四君子湯修復脾虛大鼠線粒體細胞色素氧化酶的作用及機制［J］.中國臨床康復，2006，10（35）：118－122.

［5］ 劉友章，宋雅芳，勞紹賢，等.胃脘痛患者胃黏膜超微結(jié)構(gòu)研究及中醫(yī)“脾－線粒體相關(guān)”理論探討［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2007，25（12）：2439－2442.

［6］ 馮春瓊，宋艷斌，鄒亞光，等.弱精子癥患者精子線粒體MTCYB、MTATP6基因的檢測［J］.中華男科學，2008，12（4）：321－323.