容明智，李麗，李勇文，唐春燕，龐文肖，程鈺

（桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004）

蟬翼藤（Securidaca inappendiculata Hassk）為遠(yuǎn)志科、遠(yuǎn)志族五味藤屬攀援灌木，是廣西民族特色中草藥，廣西民間稱五味藤、丟了棒、一摩消等，為傳統(tǒng)名藥云香精、正骨水的主藥之一。其根莖味辛、甘、苦，性微寒。有祛風(fēng)濕、清熱利尿、活血化瘀、消腫止痛的功效，民間常用于治療急性黃疸性肝炎的濕熱黃疸等證［1］，現(xiàn)有的藥理學(xué)研究表明，蟬翼藤具有較強(qiáng)的抗菌消炎、抗癌、抗病毒、抗HIV、免疫增強(qiáng)等多種活性，具有較好的研究?jī)r(jià)值［2～5］。據(jù)報(bào)道蟬翼藤有機(jī)酸成分具有抗乙肝病毒的作用，對(duì)鴨乙肝病毒所致的鴨肝細(xì)胞損傷也有較好的保護(hù)作用［2］，為了進(jìn)一步明確蟬翼藤有機(jī)酸中具有保肝作用的活性成分，本課題組對(duì)蟬翼藤有機(jī)酸成分進(jìn)一步分離純化，得到化合物Ⅰ～Ⅲ三種白色結(jié)晶，利用小鼠急性肝損傷實(shí)驗(yàn)對(duì)三種化合物進(jìn)行活性篩選實(shí)驗(yàn)，證明Ⅰ結(jié)晶保肝作用最強(qiáng)。經(jīng)鑒定Ⅰ結(jié)晶為甲基阿魏酸（meth－ferulic acid，MFA）。

本課題通過采用肝星狀細(xì)胞（HSC－T6），應(yīng)用四甲基噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)MFA對(duì)PDGF－BB刺激的HSC細(xì)胞增殖的影響，為進(jìn)一步研究MFA抗纖維化作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 肝星狀細(xì)胞系HSC－T6，為SV40轉(zhuǎn)染SD大鼠，其表型為活化的HSC。由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室培養(yǎng)傳代。

1.2 藥物與試劑 MFA是從廣西特色中草藥蟬翼藤莖皮中提取、分離、純化得到一種單體，純度98%以上，由本課題組自行制備。PDGF－BB：上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司（CYT－501）；胰酶蛋白：北京博艾爾科技有限公司（20111208）；DMEM培養(yǎng)基：上海泛柯生物北京分公司（20111206）；小牛血清：上海酶聯(lián)生物科技有限公司（20110302）；二甲亞砜：上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司（20110112）；青霉素：哈藥集團(tuán)制藥總廠（20110324）；鏈霉素：哈藥集團(tuán)制藥總廠（20110405）。

1.3 儀器 自動(dòng)酶標(biāo)儀Model450：美國Bio－Rad公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 空白對(duì)照組：不加任何藥物處理；模型組：PDGF－BB 10ng／ml；不同濃度 MFA處理組，即 MFA2.5μg／ml＋PDGF－BB 10ng／ml組；MFA 5μg／ml＋PDGF－BB 10ng／ml組；MFA 10μg／ml＋PDGF－BB 10ng／ml組；MFA20μg／ml＋PDGF－BB 10ng／ml組；MFA 40μg／ml＋PDGF－BB 10ng／ml組。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)步驟［2］①取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 HSC細(xì)胞接種于細(xì)胞瓶，用濃度為0.25%的胰蛋白酶液消化，使細(xì)胞脫壁，然后置于離心機(jī)離心并用臺(tái)盼藍(lán)染色及計(jì)數(shù)，用DMEM培養(yǎng)液（含10%小牛血清）配制成濃度1×105／ml的細(xì)胞懸液，加入96孔培養(yǎng)板，按100μ1／孔的量加入，每組均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，放置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。試驗(yàn)重做5次。②首先進(jìn)行藥物同步化處理細(xì)胞后，接著用PDGF－BB刺激30min，然后再分別加入不同濃度的MFA共同孵育；空白對(duì)照組不加任何藥物進(jìn)行處理；模型對(duì)照組僅用PDGF－BB刺激；分別將96孔板放置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72h。③終止培養(yǎng)前4h每孔加入20μl的MTT液，繼續(xù)孵育4h后，再吸去上清液，細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗滌一次，然后加入二甲亞砜（DMSO）使細(xì)胞裂解，每孔150μl，置于酶標(biāo)儀中，振蕩溶解10min，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值。④計(jì)算各處理組細(xì)胞的平均生長(zhǎng)抑制率的公式如下：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率＝［（模型組對(duì)照組－正常對(duì)照組）－（藥物處理組－正常對(duì)照組）］／（模型組對(duì)照組－正常對(duì)照組）×100%。

2 結(jié)果

MFA對(duì)PDGF－BB刺激的HSC－T6增殖作用的影響：對(duì)加入外源性刺激因子PDGF－BB（10ng／ml）刺激的模型組與不加外源性刺激因子的正常對(duì)照組加以比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSC－T6在24h處有一定變化，而在48、72h處增殖較為明顯，其中以48h增殖最為顯著；對(duì)不同濃度MFA作用組與PDGFBB刺激組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同濃度MFA作用組均能抑制PDGF－BB刺激的HSC增殖，并且隨MFA濃度增加抑制作用增強(qiáng)。結(jié)果見表1、表2。

表1 MFA對(duì)PDGF－BB刺激的HSC－T6增殖的影響 （±s，每組n＝5）

表1 MFA對(duì)PDGF－BB刺激的HSC－T6增殖的影響 （±s，每組n＝5）

注：與空白對(duì)照組比較，a：P ＜0.05，b：P ＜0.01；與模型對(duì)照組比較，c：P＜0.05，d：P＜0.01

組別 劑量（μg／ml）吸光值（OD值）24h 48h 72h空白組 － 0.316±0.025 0.538±0.028 0.603±0.020模型組 － 0.337±0.033a0.745±0.031b 0.795±0.017ac MFA 組 2.5 0.323±0.031 0.732±0.022ac 0.754±0.033bc 5 0.338±0.021ac 0.687±0.046bc 0.734±0.053bc 10 0.343±0.033bc 0.629±0.040bc 0.684±0.039bd20 0.367±0.024bd 0.588±0.033bd 0.654±0.047bd 40 0.361±0.014bd 0.561±0.024bd 0.632±0.037bd

表2 MFA對(duì)PDGF－BB刺激的HSC－T6增殖的抑制率 （n＝5）

3 討論

在各種病因引起的慢性肝臟疾病中，每一種損傷性因素所引起的肝臟病變都可能引起肝細(xì)胞壞死、炎癥，并且進(jìn)一步繼發(fā)纖維化的病理生理特征。肝纖維化是發(fā)展到肝硬化的一個(gè)必經(jīng)階段，HSC活化增殖并合成分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)是肝纖維化發(fā)生進(jìn)展進(jìn)程的中心環(huán)節(jié)，因此抑制HSC的活化增殖就成為防治肝纖維化的有效策略之一，也是肝纖維化防治研究的熱點(diǎn)［6，7］。

肝纖維化中的PDGF主要來自血液中的血小板、肝庫普弗細(xì)胞、星狀細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞等。PDGF包括－AB、－AA、－BB三種形式，其中PDGF－BB主要位于肝臟部位，促進(jìn)HSC增殖的作用也最強(qiáng)。PDGF－BB是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的促進(jìn)HSC增殖的因子之一，對(duì)HSC的活化和增殖具有明顯的促進(jìn)作用，在抗肝纖維化研究中十分受到重視。肝纖維化發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程中，PDGF分泌增加而且能通過其膜受體激活肝星狀細(xì)胞內(nèi)的ERK1／2、PI3－K、JAK／STAT等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中PDGF激活的最主要的途徑是ERK1／2通路，從而進(jìn)一步促進(jìn)HSC活化增殖，以及膠原和α－SMA的合成而促進(jìn)纖維化進(jìn)展。因此，PDGF是肝纖維化過程中重要的損傷因素，阻斷PDGF對(duì)HSC生物學(xué)行為的作用，將成為抗肝纖維化藥物研究的一條重要途徑［8］。MFA是本研究組從廣西特色植物蟬翼藤中提取分離純化而得到的單體化合物，本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明MFA對(duì)肝纖維化有明顯的防治作用。但是，MFA對(duì)PDGF－BB刺激的HSC增殖活性是否有影響尚未見報(bào)道。

因此，課題本部分以從廣西特色中草藥蟬翼藤中提取分離得到的MFA作為干預(yù)藥物，觀察其對(duì)PDGF－BB刺激的HSC增殖活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明2.5、5、10、20、40μg／ml濃度的MFA，對(duì)PDGF－BB刺激的HSC增殖活性具有明顯抑制效應(yīng)，提示MFA能有效抑制PDGF－BB對(duì)HSC的增殖及其生物行為特性的作用，以時(shí)間48h、濃度40μg／ml為最佳。但是MFA抑制作用的分子機(jī)制尚不清楚，是否與PDGF－BB通過其膜受體激活信號(hào)通路活性有關(guān)，尚待進(jìn)一步深入研究，本課題組將在以后的實(shí)驗(yàn)中做進(jìn)一步的探索。

［1］ 中國科學(xué)院昆明植物所.云南植物志［M］.北京：科學(xué)出版社，1983：261.

［2］ 李勇文，李麗，張士軍.含蟬翼藤大鼠血清的免疫調(diào)節(jié)作用［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2007，24（6）：452－456.

［3］ 李勇文，李麗，李梅，等.蟬翼藤對(duì)小鼠脾細(xì)胞體外增殖和淋巴因子分泌水平的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2006，13（5）：43.

［4］ 李勇文，李麗，李植飛.五味藤抗炎作用及其機(jī)制初探［J］.中國中醫(yī)急癥，2006，15（8）：898－900.

［5］ 李麗，李勇文，唐愛存.蟬翼藤氯仿提取物的抗炎和免疫增強(qiáng)作用［J］.中藥藥理與臨床，2011，27（4）：62－64.

［6］ 張士軍，張志偉，陳兆霓，等.復(fù)方六月青對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（3）：135－137.

［7］ 陳蓮香，舒建昌.PDG與肝纖維化關(guān)系的研究新進(jìn)展［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2011，20（1）：95－98.

［8］ 曹榮娟，李俊，詹迪迪，等.玉屏風(fēng)多糖對(duì)肝星狀細(xì)胞中PDGF－BB、PDGFR－β的表達(dá)及ERK1／2通路的影響［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46（9）：861－864.