雷菠，曲鑫建，李韜，孔保慶，莫頌軼，王鳳永

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，廣西 百色 533000 E－mail：qxjnm312＠yahoo.com.cn；2.大連理工大學(xué)干細(xì)胞與組織工程研發(fā)中心，遼寧 大連 116024）

近年來，廣西地方性肝臟疾病流行廣泛，嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)鼐用窠】担?，2］。隨著肝臟病治療技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞移植治療備受關(guān)注，利用干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)的“人工肝臟”修復(fù)功能缺失的組織器官成為技術(shù)要點(diǎn)［3，4］。肝組織工程就是利用三維支架、種子細(xì)胞在適宜的環(huán)境中構(gòu)建體外可移植的肝臟替代組織，以求解決治療肝臟疾病這一難題［5～7］。殼聚糖（chitosan，C）、硫酸肝素（heparin sulfate，HS）和透明質(zhì)酸（hyaluronate，Ha）是具有很好的生物相容性的藥用天然材料［8～10］。已有研究通過對C的改性，構(gòu)建與其他材料的復(fù)合支架等進(jìn)行臨床應(yīng)用，但是此類支架的性能存在著不同的缺陷，如孔的貫穿性不大，支架與細(xì)胞的黏附率不高等［11，12］。復(fù)合生物材料加入Ha，則孔的貫穿性較好，細(xì)胞在支架上分布均勻［13，14］；復(fù)合支架中若有 Hs，則利于肝前體細(xì)胞生長［15］。筆者研究一種新型C－HS－Ha復(fù)合支架，并探索此支架與肝干細(xì)胞（hepatic stem cells，HSCs）共培養(yǎng)模型，用于體外構(gòu)建適合細(xì)胞生長增殖和細(xì)胞黏附作為三維支架材料3D模型，為用于肝組織工程和藥物篩選奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 表皮生長因子（EGF），胰島素（insulin），膠原酶（Sigma），溶 菌 酶 （Sigma）DMEM／F12 粉 （Gibco），Hoechst33342（Sigma），CCK－8Kit（日本同仁化學(xué)研究所。C（90%的脫乙酰度）、HS和Ha購于上海伯奧生物科技有限公司。2－嗎啉乙烷磺酸 （MES），碳化二亞胺（EDAC），N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）購于北京恒業(yè)中遠(yuǎn)化工有限公司。

冷凍干燥機(jī)（德國GT2－9）；倒置相差顯微鏡（OLYMPUS IX70）；掃描電子顯微鏡（日立公司S2520）；酶標(biāo)儀（Thermo Labsystems MK3）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 支架材料的制備 在60℃水浴下，將 HS、Ha各以0.036%（W／V）一起溶于水，作為原液1；將C溶于2%（V／V）的乙酸溶液制得百分含量為1.8%（W／V）的原液2，進(jìn)行離心、除渣和脫泡。將原液1∶原液2以體積比為3∶7、4∶6、5∶5混合后，高速旋轉(zhuǎn)震蕩，使成分混勻充分，靜置除泡。取96孔板，每孔注入200ml混合液，預(yù)凍4h（－80℃冰箱），冷凍干燥24h，支架成型。隨后進(jìn)行交聯(lián)支架，將支架浸入含50mmol／L MES、50mmol／L EDAC、50mmol／L NHS的40%（V／V）乙醇試劑中，室溫交聯(lián)6h。將交聯(lián)劑去除，為中和殘留乙酸，再加入0.1mol／L Na2HPO4（pH＝7.4）室溫孵育2h；用乙醇40%（V／V）清洗4次，每次30min，經(jīng)雙蒸水反復(fù)沖洗至pH值為7.0左右，再次冷凍干燥，即得C－HS－Ha復(fù)合3D支架（以不加Ha和HS制備的C復(fù)合支架作為對照組）。相差顯微鏡下觀察，選擇結(jié)構(gòu)均一的支架，修剪成可適宜放置培養(yǎng)器中大小形狀，消毒備用。

1.2.2 吸水率、降解率、支架孔徑和孔隙率的測定 ①吸水率：設(shè)支架干態(tài)時的質(zhì)量為（W0），室溫下浸泡于三蒸水中24h后支架的質(zhì)量為（W1），分析天平稱量。則支架材料吸水率為：②降解速率：將C－HS－Ha支架放置在含有溶菌酶1×105u，膠原酶的磷酸鹽緩沖液（PBS）的試管內(nèi)，置于37℃水浴6周，每隔1周取出支架，蒸餾水洗后冷凍干燥并稱重（W）。支架材料降解率為：d（%）③平t均孔徑：將支架C－HS－Ha真空噴金后，掃描電鏡下觀察支架表面形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。在支架的內(nèi)部選取4個不同的視野，每個視野下測量10個孔徑值，計算支架的平均孔徑。④孔隙率：設(shè)C－HS－Ha支架材料的質(zhì)量（Ms），盛滿乙醇的比重瓶質(zhì)量（M1），乙醇充分充盈于支架材料孔隙并加滿乙醇后的質(zhì)量（M2），取出支架材料后的剩余乙醇與比重瓶質(zhì)量（M3），分別用分析天平稱量。材料孔隙率為：ε（%）＝

1.2.3 HSCs分離培養(yǎng) 新鮮分離細(xì)胞用F12／DMEM培養(yǎng)液懸浮，計數(shù)后以一定密度接種在6孔和24孔培養(yǎng)板中。F12／DMEM 培養(yǎng)液含10%FCS 、100u／ml青霉素 G、100μg／ml鏈霉素、5μg／ml胰島素（insulin）、各種生長因子等，于CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。一般待細(xì)胞增殖80%瓶底面積時對其傳代。

1.2.4 HSCs的種植和3D培養(yǎng) 復(fù)合支架（直徑0.5cm，高0.4cm）浸泡在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM∶F12＝1∶1）中12h，除去支架表面水分，放置于另一個孔板（ⅰ號）中。酶解消化肝干細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞的濃度（c）為每5×105cells／ml，取10μl體積（v）的細(xì)胞接種到支架上。將細(xì)胞與支架復(fù)合物置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5h，待細(xì)胞貼壁后，向ⅰ號板補(bǔ)加新鮮含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。4h后將支架移至24孔板，并向24孔板補(bǔ)加完全培養(yǎng)基，計算ⅰ號板溶液中未黏附的細(xì)胞總數(shù)a1。則細(xì)胞實(shí)際上架總數(shù)為c×v－a1。按下式計算黏附率：黏

1.2.5 細(xì)胞與支架復(fù)合物的掃描電鏡觀察 收集培養(yǎng)6天的復(fù)合支架上的細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞3次，室溫下用2.5%戊二醛固定2h，PBS洗滌細(xì)胞3次；室溫下1%鋨酸固定2h，PBS洗滌細(xì)胞2次；用乙醇分別以濃度為30%、50%、70%、80%、90%、100%系列脫水各20min。然后包埋切片噴金，電鏡下觀察。

1.2.6 細(xì)胞增殖檢測 以濃度為5×105cells／ml的HSCs，取10μl分別接種于每個C－HS－Ha復(fù)合支架組和C復(fù)合支架組中，同時以濃度為5×105cells／ml的 HSCs，體積100μl接種于96孔板培養(yǎng)（二維懸浮培養(yǎng)對照組），每組3個重復(fù)。應(yīng)用CCK－8試劑分別在第1周內(nèi)每天用酶標(biāo)儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡觀察空支架 電鏡照片顯示凍干后的C－HS－Ha復(fù)合材料呈纖維狀排列并有大小不等的隆起，其表面粗糙，呈乳白色；材料內(nèi)部有較多的孔隙，各孔隙相互貫穿，孔較均勻，呈海綿狀多孔隙結(jié)構(gòu)；孔壁厚約2.5μm（見圖1）。支架孔的結(jié)構(gòu)與原料的體積比有關(guān)，殼聚糖與明膠體積比為3∶7的復(fù)合支架最為疏松，5∶5的支架最致密。

3.2 支架孔徑、孔隙率、吸水率及黏附率的測定 C－HSHa復(fù)合支架的孔徑大部分分布在90～100μm之間，孔隙率均大于80%；孔徑和空隙率隨著C與G比例的增大而減??；當(dāng)殼聚糖與明膠質(zhì)量百分含量相同配比時（C∶0.9%，G∶0.9%），C－HS－Ha復(fù)合支架與C－G復(fù)合支架相比較，兩者孔徑和孔隙率相差不大，但前者的黏附率比后者增大約1.0倍，高達(dá)70.1% （見表1）。

2.3 掃描電鏡觀察空支架及HSCs在支架上的生長狀態(tài)HSCs接種到C－HS－Ha復(fù)合支架內(nèi)培養(yǎng)至第7天，可見細(xì)胞在支架孔壁上進(jìn)行貼壁生長且相互連接（見圖2A）；在孔隙間通過細(xì)胞連接的細(xì)胞群體（見圖2B）形成網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，使得不同孔之間的HSCs相互聯(lián)系形成上皮樣結(jié)構(gòu)。繼續(xù)培養(yǎng)1周，細(xì)胞團(tuán)簇緊密（見圖2C），覆蓋在支架表面與空隙之間，可見到大量增殖細(xì)胞。

圖1 掃描電鏡觀察C－HS－Ha復(fù)合支架兩原液（C和D）體積比：3∶7（A），4∶6（B），5∶5（C）

圖2 掃描電鏡下HSCs在C－HS－Ha復(fù)合支架內(nèi)的生長狀態(tài)

2.4 支架降解率的測定 C－HS－Ha復(fù)合支架在體外能降解，第1周降解約10%；在6周的降解測試中，前4周降解較快，之后降解較慢，到第6周降解趨于平緩，降解率達(dá)到30%左右。

2.5 HSCs在支架內(nèi)生長增殖的檢測 將等量的HSCs注入C－HS－Ha復(fù)合支架和C－G復(fù)合支架，由于支架不同，細(xì)胞的黏附率也不同，第1天所測的吸光度值不同，C－HS－Ha的吸光度值約為C－G的2倍（見圖4）。從結(jié)果來看，在C－HS－Ha和C－G支架和二維環(huán)境中培養(yǎng)，HSCs生長曲線都呈S型，由于各種環(huán)境的情況有所不同而有所差別。細(xì)胞在3D下C－HS－Ha和C－G復(fù)合支架與二維96孔板培養(yǎng)，達(dá)到最高數(shù)量值的時間分別為第6天、第5天、第4天，隨后細(xì)胞生長都進(jìn)入生長平臺期；在C－HS－Ha復(fù)合支架組中，由于C與G體積比不同，其增殖倍數(shù)也不同，體積比3∶7、4∶6、5∶5的細(xì)胞增殖倍數(shù)分別為11.3、11.2、10.3；C－G支架和二維懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞增殖倍數(shù)分別約7.8倍和3.0倍（見圖4）。

圖3 C－HS－Ha復(fù)合支架的體外降解率

3 討論

在干細(xì)胞與組織工程中，利用種子細(xì)胞、支架材料和生長因子在體外構(gòu)建的類似三維功能環(huán)境是研究重點(diǎn)。作為組織工程支架的材料要求具備以下條件：無免疫源性，生物相容性良好；生理環(huán)境材料可降解和具有疏松多孔結(jié)構(gòu)；可塑性和一定的力學(xué)支撐強(qiáng)度，利于細(xì)胞黏附和增殖［16，17］。由于C－G支架的細(xì)胞黏附率不高、孔的貫穿性不好、細(xì)胞分布均一性差，因而為了提高其黏附率、孔的貫穿性及細(xì)胞的分布均一性，我們制造了一種新支架C－HS－Ha復(fù)合支架材料，并將HSCs接種至此新支架中培養(yǎng)，進(jìn)而考察細(xì)胞黏附及細(xì)胞的生長增殖等情況。

采用冷凍干燥法制備的C－HS－Ha復(fù)合支架孔隙均勻、孔的貫穿性較好且比表面大，又具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，可維持支架的基本形狀8周時間，從而對細(xì)胞起到有效的支撐作用；該支架能夠降解，其降解產(chǎn)物對細(xì)胞無毒害作用，最重要的是HSCs接種到C－HS－Ha復(fù)合支架與C－G復(fù)合支架相比較，前者的細(xì)胞黏附率高達(dá)80%，約為后者的2倍；細(xì)胞分布比后者更均勻。這可能與以下因素有關(guān)。其一，通過調(diào)節(jié)支架表面的親水性和表面電荷而促進(jìn)細(xì)胞的黏附。三種材料除含有羥基外，C含有氨基；HS含有磺酸基；而Ha含有羧基。復(fù)合支架從成分上看增加了羥基、磺酸基、羧基官能團(tuán)進(jìn)而調(diào)節(jié)了支架表面的親水性和表面電荷，有助于促進(jìn)細(xì)胞粘附以及材料的生物相容性。其二，Ha可結(jié)合大量水的性質(zhì)使支架的吸水率增大。有報道證實(shí)Ha在體內(nèi)具有調(diào)節(jié)滲透壓及細(xì)胞遷移等生理功能［18，19］。在Ha的作用下，細(xì)胞在支架上可進(jìn)行生理遷移活動，避免了平面培養(yǎng)的接觸抑制現(xiàn)象發(fā)生，有利于在支架內(nèi)的細(xì)胞均勻生長分布；當(dāng)Ha比例降解時，支架所提供的生長空間促使細(xì)胞形成團(tuán)塊狀生長。其三，從支架結(jié)構(gòu)上看，選擇合適的條件如原料種類、原料濃度、各成分比例及冷凍干燥條件等可以制備不同的支架結(jié)構(gòu)，本支架材料的孔徑、孔隙率等都較理想，且孔的貫穿性較好，這些有利于細(xì)胞的生長。通過檢測HSCs在C－HS－Ha復(fù)合支架內(nèi)的生長增殖狀態(tài)可知，細(xì)胞在支架內(nèi)增殖約11倍，是C－G復(fù)合支架的1.4倍，是二維培養(yǎng)的3.7倍。電鏡圖片顯示，HSCs形成了網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)生長并有類似組織樣結(jié)構(gòu)，說明C－HS－Ha比C－G復(fù)合支架更適合HSCs的生長增殖。制備的HSCs在C－HS－Ha支架上培養(yǎng)方式構(gòu)成了模擬體內(nèi)3D培養(yǎng)環(huán)境，其比表面積增加并且生長空間更大，因此，在培養(yǎng)器中可以一次性多添加培養(yǎng)基不用頻繁更換，有利于細(xì)胞生長增殖。在正常生理環(huán)境上，細(xì)胞外基質(zhì)是由膠原蛋白、糖蛋白、蛋白多糖等生物大分子所組成，這些分子相互交聯(lián)成復(fù)雜功能的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)所選擇的三種材料：C、HS和Ha都屬于生物相容性良好的天然生物性材料，與細(xì)胞外基質(zhì)成分相關(guān)。C是多糖物質(zhì)，HS是蛋白聚糖類，Ha也是高分子多糖，應(yīng)用此三種原料合成支架，其成分類似于細(xì)胞外基質(zhì)成分，構(gòu)成了對細(xì)胞生長有利的環(huán)境。另外，C－HS－Ha復(fù)合支架中含有HS以其可富集環(huán)境中的生長因子的作用［20］，有利于細(xì)胞按自身信號來調(diào)節(jié)營養(yǎng)因子的釋放，更好地促進(jìn)HSCs的生長增殖等。Ha的作用使細(xì)胞分布均勻，從而提高了支架的空間利用率，因此更利于細(xì)胞的生長增殖。

圖4 HSCs的標(biāo)準(zhǔn)曲線和HS／Cs在C－HS－Ha復(fù)合支架內(nèi)的生長狀態(tài)

理想的組織工程三維支架應(yīng)該模擬體內(nèi)細(xì)胞生存的微環(huán)境，誘導(dǎo)細(xì)胞與此微環(huán)境密切接觸，并使細(xì)胞與材料很好地黏附，并最終在其上伸展與增殖，制備的C－HS－Ha復(fù)合支架，就是以此理念構(gòu)建的具有良好細(xì)胞相容性的復(fù)合支架。從整體上看，本研究所構(gòu)建的C－HS－Ha支架材料具備與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能相似的特點(diǎn)，能很好地維持細(xì)胞黏附、生長、增殖，可作為HSCs的理想三維支架材料。

表1 復(fù)合支架的孔徑、孔隙率、吸水率、細(xì)胞黏附率

［1］ 盛治國，郭家彬，彭雙清.體外細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)在藥理毒理學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2007，21（5）：444－448.

［2］ Li Z，Leunq M，Hopper R，et al.Feeder－free self－renewal of human embryonic stem cells in 3Dporous natural polymer scaffolds［J］.Biomaterials，2010，31（3）：404－412.

［3］ Irons HR，Cullen DK，Shapiro NP，et al.Three－dimensional neural constructs：a novel platform for neurophysiological investigation［J］.J Neural Eng，2008，5（3）：333－341.

［4］ Tan H，Chuc R，Payne KA，et al.Injectable in situ forming biodegradable chitosan－h(huán)yaluronic acid based hydrogels for cartilage tissue engineering［J］.Biomaterials，2009，30（13）：2499－2506.

［5］ He J，Li D，Liu Y.Fabrication and characterization of chitosan／gelatin porous scaffolds with predefined internal microstructures ［J］.Polymer，2007，48（13）：4578－4588.

［6］ Zehe C，Engling A，Wegehingel S，et al.Cell－surface heparan sulfate proteoglycans are essential components of the unconventional export machinery of FGF－2［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（42）：15479－15484.

［7］ Mao JS，Zhao LG，Yin YJ，et al.Structure and properties of bilayer chitosan－gelatin scaffolds［J］.Biomaterials，2003，24 （6）：1067－1074.

［8］ Marcos GF，Anne JM，Monika H，et al.Silk fibroin／hyaluronan scaffold for human mesenchymal［J］.Biomaterials，2009，30（28）：5068－5076.

［9］ Seidlits SK，Khaing ZZ，Petersen RR，et al.The effects of hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties on neural progenitor cell differentiation ［J］.Biomaterials，2010，31（14）：3930－3940.

［10］ 劉巨超，趙云山，劉廣民，等.肝組織工程支架評價方法研究［J］.醫(yī)療衛(wèi)生裝備，2009，30（7）：12－13，1.

［11］ 亞雄，李滌塵，趙倩，等.肝細(xì)胞體外培養(yǎng)平臺的仿生設(shè)計與構(gòu)建［J］.中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報，2010，29（6）：889－893.

［12］ 楊照，申少波，劉文晶，等.蠶絲蛋白和明膠復(fù)合組織工程材料的組織相容性研究［J］.華南國防醫(yī)學(xué)雜志，2011，25（1）：44－47.

［13］ 趙倩，劉亞雄，高琨，等.肝組織工程支架的仿生設(shè)計與有限元分析［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報，2011，45（8）：108－112.

［14］ 郝星，賀健康，高琨，等.蠶絲蛋白／明膠多孔肝組織支架的制備及性能研究［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報，2011，45（11）：121－126.

［15］ 萬濤，劉利.肝組織工程的影響因素［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11（6）：1137－1140.

［16］ 康玉占，汪艷，高毅.脫細(xì)胞化肝臟生物衍生支架的制備及鑒定［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13（8）：1505－1508.

［17］ Li K，Qu X，Wang Y，et al.Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers［J］.Journal of Biomedical Materials Research：Part A，2005，75A （2）：268－274.

［18］ Liu H，F(xiàn)an H，Wang Y，et al.The interaction between a combined knitted silk scaffold and microporous silk sponge with human mesenchymal stem cells for ligament tissue engineering［J］.Biomaterials，2008，29（6）：662－674.

［19］ Lu Q，Zhang X，Hu X，et al.Green process to prepare silk fibroin／gelatin biomaterial scaffolds［J］.Martomolecular Bioscience，2010，10（3）：289－298.

［20］ Tiyaboonchai W，Chomchalao P，Pongcharoen S，et al.Preparation and characterization of blended bombyx mori silk fibroin scaffolds［J］.Fibers and Polymers，2011，12（3）：324－333.