王 倩，鞠環(huán)宇，荊志強，李彥偉，王春媛，馬 波，王君偉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

鵝細小病毒（Goose parvovirus，GPV）病是一種主要侵害雛鵝和雛番鴨的急性、亞急性、高度接觸性傳染病，其傳染性強，死亡率高，部分病例在病鵝小腸段出現(xiàn)“香腸”狀栓，是目前危害養(yǎng)鵝業(yè)的主要傳染病之一[1]。一般認為，小鵝瘟根據(jù)流行病學(xué)、臨床特征和剖檢特點，可以做出初步診斷，但是，最急性型小鵝瘟、小鵝流感、鵝病毒性腸炎以及近年來新發(fā)現(xiàn)的鵝副粘病毒病等疾病均具有相似的臨床和剖檢特征[2-3]。為此，開展小鵝瘟的實驗室診斷研究具有重要意義。

目前已建立了許多檢測小鵝瘟病原的方法，如病毒分離試驗、ELISA[4]、Dot-ELISA[5]、反向間接血凝抑制試驗[6]、中和試驗、核酸探針[7]等，其中ELISA對人員和試劑的要求較高，且需要特異性抗體，病毒分離和中和試驗耗時較長，且鵝胚的不均一性對試驗結(jié)果影響較大，總之這些方法在臨床應(yīng)用上都沒有達到較滿意的效果。PCR作為一種新的分子生物學(xué)實驗技術(shù)，在疾病診斷中發(fā)揮著越來越重要的作用，該方法具有靈敏度高、快速特異、操作簡便等優(yōu)點。布日額[8]、姚笛[9]、劉家森[10]等建立了檢測小鵝瘟的單重PCR方法，趙研[11]等建立了二重PCR方法，程安春建立了實時熒光定量PCR方法以及尚毅建立了LAMP方法，但這些方法都是以一株GPV為參考序列的[12-13]。本試驗以NCBI上公布的7株為參考序列，旨在建立一種能夠檢測病料組織中所有GPV的特異性PCR方法，為臨床診斷GPV感染和探索各組織器官中GPV的分布規(guī)律提供有效手段。

1 材料與方法

1.1 毒株和菌株

GPV-98E（毒價為 105.15ELD50/0.2 mL）、GPMV由本實驗室保存，AIV-H5由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所田國彬副研究員惠贈，DPV購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；感受態(tài)細胞TG1由本實驗室制備。

1.2 儀器

PCR儀：Eppendorf公司；離心機5418型：Eppendorf公司；電泳儀Savant PS4000型：Promega公司產(chǎn)品；凝膠成像儀：Alpha Innotech Corporation產(chǎn)品；DK-8D型電熱恒溫水槽：上海一恒科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 試劑

蛋白酶K（購自Merck公司）；十二烷基磺酸鈉（SDS）（購自Amresco公司）；DNA Marker（購自北京全式金公司）；PCR試劑、pMD18-T載體、鼠源反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLVRT）（購自寶生物工程（大連）有限公司）；組織/細胞總RNA快速抽提試劑盒（購自哈爾濱?；锟萍加邢薰荆欢喙δ蹹NA純化回收試劑盒（購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.4 引物

1.4.1 GPV引物設(shè)計

根據(jù)Genbank發(fā)表的7株GPV的全序列，在相對保守的NS區(qū)設(shè)計了一對引物，引物完全落在7個全序列的保守區(qū)，引物之間為變異區(qū)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 GPV-NS基因所需引物Table1 Primers for amplifying GPV-NS gene

1.4.2 DPV、AIV和GPMV特異性引物

實驗室保存。

表2 特異性試驗所需引物Table2 Primers for specificity assay

1.5 病毒核酸的提取

1.5.1 GPV和DPV DNA的提取

取尿囊液425 μL，加入蛋白酶K（10 mg·mL-1）25 μL，10%SDS 50 μL，56 ℃水浴1 h，分別用酚/氯仿/異戊醇、氯仿各抽提一次，取上清加入1/10終體積的NaAc（3 mol·L-1，pH 5.2）和2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌一次，干燥后溶于20 μL滅菌去離子水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 AIV和GPMV RNA的提取

參考試劑盒說明書進行。

1.6 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

以AIV和GPMV基因組RNA為模板，分別以GMs和AIV通用下游引物作為反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄體系為25 μL，過程如下：RNA模板11.0 μL，引物（50 pmol·μL-1）2.0 μL，70 ℃水浴 5 min，冰浴5 min，再加入 5×M-MLVRT Buffer 5.0 μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）5.0 μL，RNAase抑制劑 1.0 μL，鼠源反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLVRT）1.0 μL，42 ℃水浴 90 min，70℃水浴15 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 PCR擴增及產(chǎn)物檢測

反應(yīng)體系 25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 2.0 μL，上下游引物（10 pmol·μL-1）各0.5 μL，模板1.0 μL，5 U·μL-1rTaq 0.2 μL，滅菌去離子水補足。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55.2℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃終延伸7 min，4℃終止反應(yīng)。

取5 μL PCR產(chǎn)物與1 μL上樣緩沖液混勻，以95 V恒定電壓在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳15 min，以Trans 2K plusⅡ分析并掃描記錄結(jié)果。

1.8 PCR產(chǎn)物的純化、克隆及序列測定

將PCR產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳，切下目的條帶按多功能DNA純化回收試劑盒的使用說明回收目的DNA，將純化的目的DNA 4.5 μL、pMD18-T載體0.5 μL和SolutionⅠ5 μL混勻，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細胞，挑取白色菌落接種含終濃度為50 μg·mL-1Amp+的5 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃搖振培養(yǎng)12 h，經(jīng)堿裂解法提取質(zhì)粒，Bam HⅠ/HindⅢ雙切鑒定為陽性質(zhì)粒，送往上海生工測序。

1.9 PCR的敏感性試驗

將原倍尿囊液用生理鹽水做10倍倍比稀釋（100～10-8），提取核酸后，用已建立的PCR方法進行擴增，以確定其敏感性。將提好的DNA測核酸濃度，用生理鹽水做10倍倍比稀釋，用已建立的PCR方法進行擴增，以確定其最小檢出量。

1.10 PCR的特異性試驗

用GPV-NS引物同時對GPV、DPV和AIV、GPMV的cDNA進行PCR擴增。

1.11 重復(fù)性試驗

以上試驗在相同的條件下重復(fù)3次以上，以驗證結(jié)果的可靠性。

1.12 適應(yīng)性試驗

在不同地理位置對已知樣品進行PCR檢測，以驗證此方法的可靠性。

1.13 臨床應(yīng)用

利用本試驗所建立的PCR方法檢測52份雛鵝病料，包括心、肝、腸等。具體步驟如下：將病料放于安瓶中，加3倍體積的PBS，用小剪子剪碎，轉(zhuǎn)移到研磨器中研磨，上清轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，反復(fù)凍融3次，離心取上清，按1.5.1步驟進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

PCR產(chǎn)物與DNA Marker比較，證實GPV DNA擴增大小為476 bp，與預(yù)期大小相符。

圖1 PCR擴增PCV2-ORF2基因Fig.1 Result of PCR product

2.2 序列測定

結(jié)果表明克隆得到GPV-NS基因特異性引物擴增片段基因序列全長476 bp，與7株參考毒株相應(yīng)區(qū)域相似性為98.42%。

2.3 PCR的敏感性試驗

結(jié)果表明將尿囊液作105倍稀釋，即0.2 mL含有100.15個ELD50，其最低能檢出0.15個ELD50。

核酸濃度＝OD260×50×稀釋倍數(shù)/1 000＝0.4196 μg·μL-1，最小檢出4.194 pg核酸。

2.4 PCR的特異性試驗

用NS引物同時對GPV和已知對照病毒的核酸進行擴增，除GPV核酸，其他均未擴增出任何條帶，而對照病毒均已擴增出已知大小的特異性目的條帶（特異性引物見表2）。

各特異性條帶均已測序，與參考序列的同源性均高于94%以上。

圖2 GPV-NS基因片段序列Fig.2 Sequence of GPV-NS gene

圖3 敏感性試驗結(jié)果Fig.3 Sensitive result of PCR detection

圖4 核酸最低檢出限量Fig.4 Result of minimum detectability of nucleinic acid

2.5 重復(fù)性試驗

相同條件下重復(fù)以上試驗3次，結(jié)果均一致。

圖5 特異性試驗結(jié)果Fig.5 Specific result of PCR detection

2.6 適應(yīng)性試驗

在3個不同實驗室采用該方法對已知陰陽性樣品進行PCR擴增，結(jié)果與預(yù)期一致，表明其適應(yīng)性良好。

2.7 臨床應(yīng)用

應(yīng)用建立的PCR方法檢測了52份臨床感染的雛鵝病料，包括自然感染的17份和人工感染的35份，其中有50份陽性，其陽性檢出率為96.2%，2份陰性為人工感染，證實此PCR方法能夠直接檢測多種臨床病料中的鵝細小病毒的DNA，能初步用于臨床應(yīng)用。

3 討論與結(jié)論

我國是世界養(yǎng)鵝第一大國，隨著養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展，鵝病也出現(xiàn)逐步增多的趨勢，而小鵝瘟是危害養(yǎng)鵝業(yè)最嚴重的傳染病之一。為了能更加有效地防治該病，采用新型快速診斷方法是控制該病行之有效的途徑之一。目前小鵝瘟實驗室診斷方法主要有病毒分離、瓊擴試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗等，這些方法特異性不高、耗時長，不能針對病原做出快速特異的診斷。國內(nèi)外有許多學(xué)者建立了用于檢測GPV的PCR方法[8-14]，本試驗建立的PCR方法具有特異性強、敏感性高、快速簡便等特點，相信能在臨床診斷中能有良好的應(yīng)用前景。

在基因選擇方面，本試驗根據(jù)GenBank中7株GPV的全序列，選取了高度保守的NS區(qū)625～1 125 nt，以此設(shè)計了一對引物，以期能檢測所有的GPV，測序結(jié)果也證實了這一點，不僅與7株全序列具有高度同源性，也與未公布全序列的NS區(qū)具有高度的同源性。

在摸索PCR最佳反應(yīng)條件時發(fā)現(xiàn)本試驗所用的檢測引物在退火溫度52～56℃均能較特異地擴增出目的條帶，最終選擇55.2℃為退火溫度。此PCR方法可最低檢測到0.15個ELD50和4.194 pg的核酸，可在病毒的毒力和毒量之間的關(guān)系上做個橫向的參考。利用此對引物對已知DPV、AIV、GPMV的核酸進行擴增，結(jié)果均為陰性，表明此方法具有較高的特異性。

本試驗從樣品處理到完成整個檢測過程大約需8 h，比常規(guī)的病毒分離方法的時間縮短了很多。本試驗中應(yīng)用建立的PCR方法檢測了52份雛鵝病料，其中50份陽性，2份陰性屬于人工感染病料，其原因可能是雛鵝本身體質(zhì)較弱而病毒未達到臟器所致。在人工感染的病料中，在同一雛鵝上，心和肝都能檢出，而腸偶爾檢測不出，這可以為日后GPV檢測病料選取上提供依據(jù)。該方法用于臨床還有一定的距離，還需在大量臨床樣品檢測中進行實踐和摸索。

本研究是為了鵝細小病毒PCR檢測試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)的，所以以上試驗均按照農(nóng)業(yè)部制定的《獸用診斷制品試驗研究技術(shù)指導(dǎo)原則》所規(guī)定的主要技術(shù)指標實施的，但限于鵝胚的季節(jié)性，敏感性和特異性的部分試驗尚未完成，將在后期繼續(xù)完善。

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