張英華，關(guān) 雪

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

我國(guó)刺五加資源豐富且其無(wú)毒副作用，是一種理想的天然抗氧化或防腐劑的提取源，并可以作為一種營(yíng)養(yǎng)保健成分或天然的抗氧化劑添加于其他食品中。同時(shí)，植物提取物的直接開(kāi)發(fā)利用，對(duì)于植物資源的綜合開(kāi)發(fā)利用也具有十分重要的意義。

刺五加為五加科植物刺五加（Acanthopanax senticosus Harms）的干燥根及根莖，其莖葉也可作藥用，具有益氣健脾、補(bǔ)腎安神功能。它是一種我國(guó)民間常用的傳統(tǒng)中藥，具有活血，抗惡性瘧疾、抗病毒、抗腫瘤和止痛殺菌等藥效[1]，用于脾腎陽(yáng)虛，體虛乏力，食欲不振，腰膝酸痛，失眠多夢(mèng)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，刺五加具有多種藥理作用和臨床應(yīng)用[2-3]。

關(guān)于刺五加的化學(xué)成分，因其具有廣泛的生理活性而受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注,其成分含多種苷類(lèi)，包括酚性苷和脂苷等；但目前對(duì)刺五加中黃酮類(lèi)化合物的研究卻很少。黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)重要的天然化合物，是植物產(chǎn)生的一類(lèi)次生代謝產(chǎn)物，因其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)而具有許多重要的生理、生化作用，對(duì)人體健康也起著重要的作用。早在20世紀(jì)30年代，就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)黃酮類(lèi)化合物具有維生素C樣的活性。20世紀(jì)80年代以來(lái)，對(duì)黃酮類(lèi)化合物的研究逐漸轉(zhuǎn)向其清除自由基、抗衰老及對(duì)老年性疾病的防治功效上[4]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明黃酮類(lèi)物質(zhì)具有降血糖、降血脂、抗心律失常等40多種生理活性。此外，黃酮類(lèi)物質(zhì)作為抗氧化劑還廣泛應(yīng)用于食品中。近年來(lái)許多試驗(yàn)表明，由于合成抗氧化劑對(duì)人體的危害，如丁基羥基茴香醚可一起動(dòng)物肝臟增大等作用，現(xiàn)已限制或停止使用。因此，從藥食兩用植物中篩選出高效低毒且經(jīng)濟(jì)的天然抗氧化劑成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[5]。

本試驗(yàn)對(duì)刺五加中黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行了定性和定量的測(cè)定，通過(guò)DPPH、清除羥自由基等方法測(cè)定了其抗氧化活性，并采用抑菌圈等實(shí)驗(yàn)對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)的抑菌性進(jìn)行研究。為進(jìn)一步研究刺五加黃酮類(lèi)化合物以及其開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

刺五加葉粗黃酮提取物，提取方法參照文獻(xiàn)[6]。

菌種：大腸桿菌，金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌及熒光假單胞菌。

1.2 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH（Sigma）、番紅、EDTA、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、BHT、VC、無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純、牛肉膏、蛋白胨等。

1.3 主要儀器

紫外分光光度計(jì)、無(wú)菌操作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、滅菌鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、真空泵、水浴鍋、移液器、電子天平等。

1.4 方法

1.4.1 總黃酮含量的測(cè)定

1.4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取0.1 mol·L-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，加30%乙醇至5.0 mL，加5%亞硝酸鈉0.4 mL，搖勻，放置5 min，再加10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，放置5 min，加4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，搖勻，最后加30%乙醇定容至刻度，搖勻，放置10 min。在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度。以濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]。

1.4.1.2 樣品溶液的制備及含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取用石油醚脫脂的刺五加粉末2 g，用70%乙醇按1∶20料液比浸泡回流提取1 h，提取3次，合并濾液，濃縮后所得濾液置于100 mL容量瓶并定容至刻度，搖勻。按1.4.1.1方法測(cè)定吸光度。

1.4.2 刺五加葉總黃酮抗氧化性測(cè)定

1.4.2.1 還原能力測(cè)定[7]

取2.5 mL不同濃度的黃酮溶液，加入0.2 mol·L-1pH 6.6磷酸鹽緩沖液2.5 mL及l(fā)%鐵氰化鉀2.5 mL，50℃水浴20 min，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL于3 000 r·min-1離心10 min，取上清液5 mL，加蒸餾水4 mL，及0.1%FeCl30.5 mL，混勻后于700 nm處測(cè)定吸光值。

1.4.2.2 清除超氧陰離子自由基實(shí)驗(yàn)[8]

在10 mL試管中加入4.5 mL pH 8.2磷酸緩沖液，25℃水浴20 min，分別加入1 mL不同濃度的試樣溶液和25℃預(yù)熱的0.4 mL 25 mol·L-1的鄰苯三酚溶液并振蕩3 min后立即加入100 μL 3%抗壞血酸，振蕩均勻。在320 nm處測(cè)定吸光度。

式中，A0-不加樣品時(shí)吸光度；A1-加入樣品的吸光度；A2-不加鄰苯三酚樣品的吸光度。

1.4.2.3 清除羥基自由基實(shí)驗(yàn)方法[9]

在10 mL試管中加入磷酸緩沖液1.0 mL，番紅0.2 mL，EDTANa2-Fe2+1.0 mL，再加入不同濃度的樣品溶液7.0 mL，最后加入H2O2溶液0.8 mL，混勻后于40℃水浴30 min，在520 nm處測(cè)吸光度A值。試驗(yàn)結(jié)果以清除率E表示：

式中，A對(duì)照—以等體積的重蒸水代替樣品溶液和H2O2溶液的吸光度。A空白—以等體積的重蒸水代替樣品溶液的吸光度。

1.4.2.4 抑制DPPH自由基試驗(yàn)[10]

在10 mL試管中分別加入取各濃度測(cè)定液2 mL及2×10-4mol·L-1DPPH 2 mL，搖勻，30 min后在517nm測(cè)定其吸光度Ai，同時(shí)測(cè)定2 mL2×10-4mol·L-1DPPH溶液與2 mL無(wú)水乙醇混合液的吸光度Ac，以及2 mL測(cè)定液與2 mL無(wú)水乙醇混合液的吸光度Aj，根據(jù)下式計(jì)算測(cè)定液對(duì)DPPH的抑制率。

1.4.3 刺五加葉總黃酮提取物抑菌性測(cè)定

1.4.3.1 不同濃度黃酮提取物抑菌效果的比較[11]

配制濃度為1，2，4，6，8 g·L-1的刺五加黃酮提取物。用已滅菌的移液管分別移取以上五種濃度的刺五加黃酮溶液4 mL至已滅菌的液體培養(yǎng)基中，用4 mL無(wú)菌水做對(duì)照。在各培養(yǎng)基中接種1 mL供試菌懸液，搖床培養(yǎng)24 h，測(cè)定在OD600菌懸液的吸光度。

1.4.3.2 抑菌圈試驗(yàn)[12-15]

在上述五種不同濃度的刺五加黃酮溶液中分別放入直徑為6 mm的滅菌濾紙片，浸泡12 h，干燥后，用紫外線照射滅菌10～15 min。用無(wú)菌鑷子將浸透5種濃度的刺五加黃酮溶液的濾紙片放在含菌平板上，培養(yǎng)皿放到供試菌最適生長(zhǎng)溫度下培養(yǎng)48 h。用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑的大小，并以此判斷不同濃度的刺五加黃酮溶液對(duì)供試菌的抑制效果。結(jié)果以mm表示，生理鹽水做空白對(duì)照。為保證所測(cè)數(shù)據(jù)的精確性，每種菌作3個(gè)重復(fù)。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用單因子方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。與對(duì)照組比較，當(dāng)P＜0.01表示具有極顯著性差異，P＜0.05表示具有顯著性差異，當(dāng)P＞0.05時(shí)差異無(wú)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定和回歸方程的建立

按1.4.1.1所示方法進(jìn)行測(cè)定，由圖1可得回歸方程C=0.0091x-0.0073，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9992

2.2 刺五加葉中總黃酮含量

按1.4.1.2所示的方法進(jìn)行測(cè)定，做3次平行，得刺五加中總黃酮化合物的含量為0.34%。

2.3 刺五加葉總黃酮抗氧化能力的測(cè)定結(jié)果

2.3.1 還原能力測(cè)定

按1.4.2.1所示方法進(jìn)行測(cè)定，以樣品吸光值與濃度數(shù)據(jù)作圖，如圖2可知，刺五加黃酮樣品具有較好的還原能力，是良好的電子供應(yīng)者，其供應(yīng)的電子可以使Fe3+還原成Fe2+，且隨著刺五加黃酮濃度的增加其抗氧化能力也增加。

圖1 蘆丁溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

圖2 不同濃度的刺五加黃酮溶液還原能力的比較Fig.2 Comparison of the reductive ability of different concentrations of acanthopanax flavonoids

2.3.2 清除O2-試驗(yàn)結(jié)果

按1.4.2.2所示方法進(jìn)行測(cè)定，以清除率與濃度數(shù)據(jù)作圖，如圖3。以0.2 mg·mL-1BHT、VC和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品做對(duì)照，見(jiàn)表1。

表1 0.2 mg·mL-1樣品、VC、BHT及蘆丁標(biāo)品清除O2-.能力的比較Table 1 Comparison of clear O2-.ability of 0.2 mg·mL-1samples,VC,BHT and rutin

圖3 不同濃度的刺五加黃酮溶液清除O2-﹒能力的比較Fig.3 Comparison of clear O2-﹒ability of different concentrations of acanthopanax flavonoids

由表1和圖3可知，不同濃度的刺五加葉黃酮類(lèi)化合物及VC、BHT及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品都有較好的清除O2-能力，并隨著刺五加黃酮類(lèi)化合物含量的增加對(duì)O2-的清除率不斷上升。當(dāng)VC的濃度為0.2 mol·L-1時(shí)清除O2-能力達(dá)到78.9%，蘆丁和BHT清除O2-能力相近，分別為36.5%和42.7%，而相同濃度的刺五加黃酮的抗氧化性就不及前兩者，只有23.4%。但總的來(lái)說(shuō)，刺五加黃酮有較好的清除O2-能力。

2.3.3 清除·OH試驗(yàn)結(jié)果

按1.4.2.3所示方法進(jìn)行測(cè)定，以清除率與濃度數(shù)據(jù)作圖，如圖4。以0.2 mg·mL-1BHT、VC和蘆丁標(biāo)品做對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖4 不同濃度的刺五加黃酮溶液清除·OH能力的比較Fig.4 The comparison of clear·OH ability of different concentrations of acanthopanax flavonoids

表2 0.2 mg·mL-1的樣品、VC、BHT及蘆丁標(biāo)品清除·OH能力的比較Table 2 Comparison of clear·OH ability of 0.2 mg·mL-1samples,VC,BHT and rutin

由表2和圖4可知，不同濃度的刺五加黃酮類(lèi)化合物對(duì)OH-有較強(qiáng)的清除能力，刺五加黃酮類(lèi)化合物濃度在0.2 mg·mL-1時(shí)清除率為73.9%，并隨著刺五加黃酮濃度的增加，OH-清除能力越來(lái)越強(qiáng)，濃度為0.2 mg·mL-1L的蘆丁標(biāo)品清除·OH的能力最強(qiáng)，達(dá)到91.3%。相同濃度0.2 mg·mL-1刺五加黃酮清除·OH的能力較VC要好得多。

2.3.4 清除DPPH自由基試驗(yàn)結(jié)果

按1.4.2.4所示方法進(jìn)行測(cè)定，以清除率與濃度數(shù)據(jù)作圖，結(jié)果見(jiàn)圖5。

以0.2 mg·mL-1BHT、VC和蘆丁標(biāo)品做對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 0.2 mg·mL-1的樣品、VC、BHT及蘆丁標(biāo)品清除DPPH能力的比較Table 3 Comparison of clear DPPH ability of 0.2 mg·mL-1samples,VC,BHT and rutin

圖5 不同濃度的刺五加黃酮溶液清除DPPH能力的比較Fig.5 Comparison of clear DPPH ability of different concentrations of acanthopanax flavonoids

由表3和圖5可知，在0.05～0.8 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)，樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著濃度的升高顯著增強(qiáng)。而作為對(duì)照的VC、BHT及蘆丁標(biāo)品，在所選的濃度下，BHT的清除能力明顯強(qiáng)于樣品和VC，0.2 mg·mL-1的BHT的清除率達(dá)到68.2%，在同一濃度下，蘆丁標(biāo)品的清除DPPH的能力最強(qiáng)，達(dá)到81.9%，VC的清除能力最弱為16.9%。

2.4 刺五加葉總黃酮提取物抑菌作用試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 液體培養(yǎng)法測(cè)定刺五加葉中總黃酮對(duì)各菌種的抑菌效果

由圖6可知，刺五加黃酮對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌及熒光假單胞菌具有較強(qiáng)的抑制性，且隨著刺五加葉總黃酮濃度的不斷增加，其抑菌性能也逐漸增強(qiáng)。刺五加葉總黃酮提取物濃度為8 g·L-1時(shí)，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌及熒光假單胞菌的抑菌率分別為83.1%、82.2%、69.0%和57.1%，由此可初步確定刺五加葉總黃酮提取物對(duì)各種菌的抑制效果由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋捍竽c桿菌＞金黃色葡萄球菌＞沙門(mén)氏菌＞熒光假單胞菌，平板試驗(yàn)結(jié)果與吸光度變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

圖6 加入不同濃度刺五加黃酮各菌懸液抑菌率的比較Fig.6 Comparison of bacteriostatios ratio of different concentrations of acanthopanax flavonoids

2.4.2 抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果

表4結(jié)果表明，刺五加葉黃酮提取物對(duì)供試菌有較顯著的抑制作用，并且隨著刺五加黃酮提取物濃度的增加，其抑菌效果明顯增高，尤其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果更佳，抑菌圈直徑分別為19.3，18.7 mm，對(duì)熒光假單胞菌的抑制效果稍弱。并且在P＜0.05范圍內(nèi)各濃度黃酮提取物間對(duì)供試菌的抑制率差異顯著。

表4 不同濃度刺五加葉黃酮提取物對(duì)供試菌的抑菌效果Table 4 Bacteriostatic effect of different concentration acanthopanax flavonoids to the test bacteria

3 討論與結(jié)論

a.本試驗(yàn)采用乙醇回流法提取刺五加葉中的黃酮類(lèi)化合物，采用分光光度法以蘆丁為標(biāo)樣測(cè)定其中總黃酮提取物的含量為0.34%。由于試驗(yàn)中僅以蘆丁為標(biāo)樣進(jìn)行測(cè)定，其他吸收峰由于缺乏標(biāo)樣仍不能準(zhǔn)確定性與定量。若能分離得到更多刺五加黃酮類(lèi)化合物組成物質(zhì)的標(biāo)樣，將有助于建立精度高的刺五加葉總黃酮含量的分析方法。

b.刺五加葉總黃酮提取物具有較明顯的抗氧化作用，并隨提取物添加量的增加而增強(qiáng)。通過(guò)抗氧化試驗(yàn)，得到以下結(jié)論：①?gòu)那宄u自由基的試驗(yàn)可以看出，刺五加黃酮提取物在低濃度時(shí)清除能力較弱，當(dāng)添加濃度達(dá)0.2 mg·mL-1時(shí)清除率達(dá)到73.9%；②通過(guò)清除超氧陰離子的比較實(shí)驗(yàn)表明，0.2 mg·mL-1的黃酮提取物和BHT清除O2-的清除率分別為23.4%和42.7%，說(shuō)明該黃酮提取物具有較強(qiáng)的清除超氧陰離子能力；③從清除DPPH實(shí)驗(yàn)可知，刺五加黃酮提取物的清除能力要比VC好，當(dāng)濃度為0.8 mg·mL-1時(shí)，清除率為57.8%，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的清除DPPH的能力最強(qiáng)，達(dá)到81.9%。

c.刺五加葉總黃酮提取物對(duì)各菌種均有較好的抑制作用，并隨著提取物濃度增大其抑制效果越明顯。提取物濃度為8 g·L-1時(shí)，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌及熒光假單胞菌的抑菌率分別為83.1%、82.2%、69.0%和57.1%。

通過(guò)研究可知，刺五加黃酮類(lèi)成分對(duì)細(xì)菌有較強(qiáng)的，較廣譜的抑菌活性，不過(guò)其表現(xiàn)出的治療活性成分并未研究清楚，因此在以后的研究中要繼續(xù)對(duì)刺五加總黃酮的生物活性、藥理作用進(jìn)行深入的研究，為刺五加這一野生草藥在功能食品、醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。

總之，刺五加黃酮類(lèi)化合物應(yīng)用及其廣泛，除了具有良好的抗氧化能力以外，還具有多種生物活性，如某些黃酮類(lèi)化合物對(duì)心血管疾病有防治和治療的作用及抗過(guò)敏作用等。黃酮類(lèi)化合物的生物活性和低毒作用使其在臨床上有巨大的潛力，但由于其含量低，分離難等自身的一些原因，給黃酮類(lèi)化合物的研究帶來(lái)一定的困難。因此，黃酮類(lèi)化合物的許多功能還有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和研究。

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