楊俊靜，李海濤，張冬杰，楊秀芹，劉 娣,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱 150086）

近年來，我國畜禽育種取得巨大進展，但在注重生長性能的同時，肉質(zhì)的品質(zhì)卻不能得到保障。隨著生活水平的提高，人民更希望能吃到天然、味美、健康的肉類產(chǎn)品，所以對優(yōu)質(zhì)豬肉品質(zhì)性狀的選育尤為重要。肉質(zhì)鮮味特性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)是由肌苷酸（Inosine monophosphate，IMP）、氨基酸（谷氨酸和甘氨酸）和肌內(nèi)脂肪所決定的，國際上大多以肌苷酸的含量作為肉類新鮮程度的指標(biāo)[1]。谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶（GPAT）是催化次黃嘌呤核苷酸合成過程的一種限速酶，催化次黃嘌呤合成的第一步反應(yīng)，是影響肌苷酸生成的、決定肉質(zhì)性狀的候選基因[2]。豬GPAT基因位于2號染色體上，DNA序列全長68 763 bp，包含21個外顯子，編碼826個氨基酸。先后在人[3]、鼠[4]、雞[5]上被克隆出來。本研究對民豬GPAT基因進行了克隆測序，并通過PCR-SSCP的方法對GPAT基因在民豬、野豬、北京黑豬、大白豬、長白豬和杜洛克間進行多態(tài)性研究，探討不同品種豬之間風(fēng)味特性的差異與GPAT基因的關(guān)系，為尋找與豬肉風(fēng)味品質(zhì)性狀緊密連鎖的有效分子遺傳標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

長白豬105頭、大白豬77頭、杜洛克均來自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)原種豬培育中心；北京黑豬40頭來自小嶺豬場；民豬33頭來自黑龍江省蘭西種豬場；野雜豬8頭來自黑龍江省農(nóng)科院畜牧所養(yǎng)殖基地。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集、基因組DNA和總cDNA的制備

民豬、北京黑豬、大白豬、長白豬、野豬、杜洛克6個豬種的基因組DNA樣品為本實驗室保存樣品。屠宰了3頭民豬，采集背肌、卵巢、大腸、肺、肝臟、脾、腎、腿肌、胃、小腸、心臟、子宮共12種組織器官樣品。按照Trizol Reagent總RNA提取試劑盒操作說明分別提取這12種組織的總RNA，利用1.4%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量，按照TaKaRa公司生產(chǎn)的PrimeScript RT reagen Kit試劑盒說明書方法將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 引物的設(shè)計

根據(jù)GenBank上發(fā)表的豬GPAT基因的DNA序列（XM_001927875.1）設(shè)計引物，分別對第1外顯子、第9外顯子、第14外顯子和第18外顯子進行擴增和多態(tài)性分析；根據(jù)GPAT基因的mRNA序列設(shè)計Real-time PCR擴增引物C1、C2，引物的相關(guān)信息見表1。

表1 引物相關(guān)信息Table1 Information of Primers

1.2.3 多態(tài)性檢測

以民豬、北京黑豬、大白豬、長白豬、野雜豬、杜洛克共278頭個體DNA為模板；進行PCR-SSCP反應(yīng)，凝膠濃度為18%；電泳結(jié)束后，進行銀染，顯色。

1.2.4 Real time-PCR反應(yīng)體系的建立

根據(jù)寶生物工程（大連）有限公司的SYBR，Premix Ex TaqTM II試劑盒構(gòu)建20 μL反應(yīng)體系，采用兩步法反應(yīng)，每個樣本重復(fù)3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及熒光曲線Ct值計算定量結(jié)果。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取已制備的豬12種組織cDNA樣品（50 ng·μL-1）各1 μL進行混合，利用寶生物工程（大連）有限公司的EASY Dilution試劑按10倍濃度梯度稀釋為5 ng·μL-1、500 、50、5、0.5 pg·μL-1。分別取2 μL，對1～100 ng的cDNA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

BLAST方法進行同源性比對，使用SPSS軟件進行t檢驗和χ2檢驗、用PIC-Calc 0.6軟件進行PIC值計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-SSCP檢測結(jié)果

在所檢測的4個外顯子中，第1外顯子和第14外顯子中各存在一處多態(tài)。P1F/R引物的擴增產(chǎn)物經(jīng)PCR-SSCP檢測后，共發(fā)現(xiàn)三種基因型，兩種純合型分別命名為AA、BB。對兩種純合型個體進行克隆測序發(fā)現(xiàn)，A等位基因在151、171 bp處的核苷酸分別為T、G；B等位基因分別為C、T（見圖1），151 bp處突變使苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼?。P3F/R引物的擴增產(chǎn)物經(jīng)PCR-SSCP檢測后，共發(fā)現(xiàn)三種基因型，兩種純合型分別命名為CC、DD。對兩種純合型個體進行克隆測序發(fā)現(xiàn)，A等位基因在1 937 bp處的核苷酸分別為G；B等位基因分別為T（見圖2），并引起亮氨酸變?yōu)榫彼帷?/p>

圖1 P1F/R引物PCR-SSCP電泳圖譜Fig.1 PCR-SSCP electrophoresis pattern of P1F/R primer

2.2 群體遺傳學(xué)分析

針對以上PCR-SSCP檢測結(jié)果，分析各基因型在北京黑豬、長白豬和大白豬等6個豬種中的分布規(guī)律。GPAT基因第1外顯子、第14顯子處各品種的檢測個體數(shù)、基因型頻率、基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）等統(tǒng)計參數(shù)值分別見表2和表3。

圖2 P3F/R引物PCR-SSCP電泳圖譜Fig.2 PCR-SSCP electrophoresis pattern of P3F/R primer

表2 不同品種豬GPAT基因的第1外顯子基因型頻率和基因頻率Table2 Allele ferquencies and genotype frequencies of GPAT among different swine hreeds

表3 不同品種豬GPAT基因的第14外顯子基因型頻率和基因頻率Table3 Allele ferquencies and genotype frequencies of GPAT among different swine hreeds

χ2獨立性檢驗表明在所檢測的各多態(tài)位點，不同基因型在民豬、北京黑豬、長白豬和大白豬等品種間的分布存在顯著差異（P＜0.01）。第1、14外顯子多態(tài)的χ2分割檢驗結(jié)果見表4和表5。

表4 GPAT基因第1外顯子SNP位點在不同群體中的基因型分布的χ2檢驗Table4 Chi-square testing of GPAT gene for genotype distribution of SNPs between breeds

表5 GPAT基因第14外顯子SNP位點在不同群體中的基因型分布的χ2檢驗Table5 Chi-square testing of GPAT gene for genotype distribution of SNPs between breeds

2.3 Real-time PCR定量檢測民豬12種組織中GPAT基因的表達

結(jié)果見圖3。由圖3可以看出各組織表達譜及統(tǒng)計分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過內(nèi)參β-actin對豬12種組織中GPAT基因表達量的校正，發(fā)現(xiàn)GPAT基因在肝臟中表達量較高，按照表達量從高到低依次為：肝臟＞大腸＞卵巢＞脾＞胃＞腎臟＞小腸＞肺＞心臟＞腿?。颈臣。咀訉m。

圖3 民豬12種組織中GPAT基因的表達情況Fig.3 Expression of GPAT in 12 kinds of tissues of Min pig

3 討論與結(jié)論

肌苷酸已逐漸成為衡量肉質(zhì)鮮味的一個重要指標(biāo)，在各個品種內(nèi)及品種間肌苷酸的含量也呈現(xiàn)很大的差異。Chow I S等用薄層層析法測定了雞中肌肉中肌苷酸的含量，發(fā)現(xiàn)品種、性別、日齡及組織等對肌苷酸含量有不同程度的影響[6]，隨后也有大量的研究表明不同物種在同樣的條件下所形成的肌苷酸的含量差異很大，肌肉肌苷酸的含量也隨年齡和體重的增加而逐漸減少等[7]。肌苷酸合成過程中涉及10種酶，其中GPAT基因催化次黃嘌呤合成的第一步反應(yīng)，且與AIRc基因緊密連鎖，并且由一個啟動子分向轉(zhuǎn)錄。雞GPAT-AIRc啟動子在AIRC方向的強度大約是GPAT方向的10倍[8]。

本文通過對豬GPAT基因外顯子1和14進行多態(tài)位點掃描，檢測到的三個突變位點中，兩處為錯義突變，一處為非錯義突變，其中151 bp處的錯義突變使苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼幔? 937 bp處的錯義突變使亮氨酸變?yōu)榫彼?。研究通過PCR-SSCP技術(shù)進行遺傳學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在GPAT基因第1外顯子中，民豬、長白豬、北京黑豬、杜洛克均以A等位基因為主，其中民豬沒有檢測到B等位基因，大白豬以B等位基因為主，多態(tài)信息含量（PIC）的分析結(jié)果表明各豬種均為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）。第14外顯子中長白豬、大白豬、杜洛克和野雜豬均以A等位基因為主，其中民豬沒有檢測到B等位基因，北京黑豬兩等位基因個體數(shù)相同，多態(tài)信息含量（PIC）的分析結(jié)果表明各豬種均為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）不同基因型在民豬、北京黑豬、長白豬、大白豬、杜洛克和野雜豬間的分布存在著極顯著差異（P＜0.05）。

本試驗通過實時熒光定量PCR方法檢測了GPAT基因在各組織中的表達差異，發(fā)現(xiàn)在肝臟中的表達量最高。從這一結(jié)果可以看出，肝臟在肌苷酸合成過程中具有重要的生理作用。由于缺乏相應(yīng)個體肌苷酸含量的數(shù)據(jù)，本研究所得多態(tài)位點是否是不同豬種肉質(zhì)風(fēng)味差異的影響因素之一尚有待于進一步驗證。

[1]Fuijmura S.Identification of tuste-active component components in the meat of the Japanese native chicken,Hinaidori and broilers and the effent of feeding treatments on taste-active components[J].Animal food science 1998,50(2):99-158.

[2]Zhou G C,Dixon J E,Zalk IN H.Cloning and expression of avian glutamine phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase.Conservation of a bacterial propeptide sequence supports a role for posttranslational processing[J].Journal of Biological Chemistry,1990,265(34):21152-21159.

[3]Wahana H,Oka J,Mizusawa N,et al.Molecular cloning of human amidophos phoribosyl transferase[J].Biochem Biophys Res Commun,1993,190(1):192-200.

[4]Wahana H,Yamaoka T,et al.Molecular cloning of rat Amidophoribosyltransferase[J].J Biol Chem.,1993,268(10):7225-7237.

[5]Gavalas A,Zalkin H.Analysis of the chicken GPAT/AIRC bidirectional promoter for denovo purine nucleotide synthesis[J].J Biol Chem,1995,270(5):2403-2410.

[6]Chow I S,Jacobson M.Inosine monphosphate,inosine and hypoxanthine in meat from broiler 5,7,and 9 weeks of age[J].Poultry Sci,1968,47:604.

[7]陳國宏,李慧芳,吳信生,等.泰和烏骨雞肌肉肌苷酸含量變化規(guī)律及其遺傳力估測[J].揚州大學(xué)學(xué)報:農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2002,23(2):29-32.

[8]Gavalas A,Zalkin H.Coexpression of two closely linked avian genes for purine nucleotide synthesis from a bidirectional promoter[J].Mol Cell Biol,1993,13(12):7977.

[9]張海艷,于太永,關(guān)偉軍.肌苷酸形成機理及其含量影響因素淺析[D].山西:山西農(nóng)業(yè)大學(xué),2004,6(3):17-21.

[10]束婧婷.雞肌苷酸候選基因遺傳效應(yīng)及表達規(guī)律研究[D].揚州:揚州大學(xué),2008:78-79.