齊 晅 靳洪濤張風(fēng)肖 (河北省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，河北 石家莊 050000)

依達(dá)拉奉對(duì)大鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的治療作用及其機(jī)制

齊 晅 靳洪濤1張風(fēng)肖 (河北省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，河北 石家莊 050000)

目的 觀察依達(dá)拉奉(MCI-186)對(duì)大鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)的治療作用及其可能機(jī)制。方法 選用24只成年雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分成4組，每組6只，分別為正常組，模型組，依達(dá)拉奉低、高劑量組。測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠的踝關(guān)節(jié)足墊厚度，生化方法檢測(cè)了各組大鼠血漿總超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量、對(duì)大鼠滑膜組織進(jìn)行組織核因子-κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子(TNF)-α的SP免疫組織化學(xué)染色，采用真彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。取大鼠雙膝關(guān)節(jié)滑膜組織，光鏡下觀察關(guān)節(jié)滑膜襯里層細(xì)胞(LCC)增生，襯里下層炎細(xì)胞浸潤(rùn)及血管翳形成等病理變化。結(jié)果 與正常組相比，模型組血漿總SOD活力下降，MDA含量升高，滑膜組織NF-κB、TNF-α表達(dá)增加。依達(dá)拉奉高低劑量組均能提高血漿總SOD活力，降低MDA含量，使滑膜NF-κB、TNF-α表達(dá)下降，但兩組比較無(wú)差異。組織形態(tài)學(xué)光鏡下表明依達(dá)拉奉組滑膜襯里層增生減少，少見血管翳的形成。結(jié)論 依達(dá)拉奉對(duì)CIA大鼠有明顯的抗氧自由基及抗炎作用，能夠降低CIA大鼠足墊腫脹程度，抗氧化及抑制炎性因子可能是其主要作用機(jī)制。

依達(dá)拉奉;膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎;自由基;炎性細(xì)胞

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 (RA)是一種以多關(guān)節(jié)受累為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，尚未完全闡明。自由基在RA的發(fā)生及發(fā)展過程中的地位逐漸受到重視。依達(dá)拉奉是一種新型的自由基清除劑，目前主要應(yīng)用于腦缺血的治療，其通過清除自由基治療RA的研究報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)以自由基與RA的關(guān)系為出發(fā)點(diǎn)，應(yīng)用自由基清除劑依達(dá)拉奉治療膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎 (CIA)大鼠，探討依達(dá)拉奉對(duì)關(guān)節(jié)炎治療的效果，并為其抗炎機(jī)制尋找可能的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠30只，8～12周齡，體重140～160 g，河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)805154，許可證號(hào)SCXK(冀)2003-1-003。自由飲水，攝食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 依達(dá)拉奉購(gòu)于吉林博大制藥有限公司(30 mg/支)，注射用氯諾昔康購(gòu)于浙江震元制藥有限公司(8 mg/支)，雞Ⅱ型膠原 (0.5 mg/支)及完全弗氏佐劑(CFA，10ml)購(gòu)于Sigma公司，大鼠丙二醛 (MDA)、超氧化物歧化酶 (SOD)的測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，大鼠NF-κB(p65)、腫瘤壞死因子 (TNF)-α免疫組化試劑盒抗體購(gòu)自Santa公司，卡介苗 (BCG，50 mg/支)購(gòu)于北京生物制品研究所、EDTA脫鈣劑購(gòu)自華瑞創(chuàng)新生物科技開發(fā)中心。721-B分光光度計(jì) (上海分析儀器三廠)。

1.3 分組 大鼠隨機(jī)分選取6只，作為正常對(duì)照組，余24只建立CIA大鼠模型，造模成功率為75%，把模型鼠隨機(jī)分為模型組，依達(dá)拉奉低劑量組 (3.0 mg/kg，2次/d)，依達(dá)拉奉高劑量組 (6.0 mg/kg，2次/d)。

1.4 CIA模型的建立及給藥〔1〕將雞CCⅡ以5 g/L的濃度溶于0.01 mol/L的醋酸溶液，然后和等體積完全弗氏佐劑在4℃水浴用超聲乳化儀混勻。其中卡介苗的濃度為2 g/L。于實(shí)驗(yàn)第1天第造模組大鼠的尾根部皮內(nèi)注射上述乳劑0.1 ml，正常對(duì)照組大鼠于尾根部皮內(nèi)注射0.1 ml生理鹽水。于實(shí)驗(yàn)第2周用同樣劑量免疫原在相同部位再次免疫造模組大鼠，第2次免疫后約1 w左右出現(xiàn)多發(fā)性關(guān)節(jié)炎。于致炎后第18天:依達(dá)拉奉低高劑量組分別給予依達(dá)拉奉3.0、6.0 mg/kg，2次/d腹腔注射;正常對(duì)照組大鼠給予生理鹽水0.5 ml/d腹腔注射，給藥時(shí)間均固定在每天8時(shí)及20時(shí)。

1.5 CIA大鼠標(biāo)本的采集及處理 于實(shí)驗(yàn)的第28天全部大鼠摘取眼球取血，并取膝關(guān)節(jié)滑膜組織，全部置于4%多聚甲醛固定，行HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 關(guān)節(jié)腫脹度的評(píng)定 于實(shí)驗(yàn)的第0，3，6，9，12，15，18，21，24，27天用游標(biāo)卡尺測(cè)量右后足掌厚度，分別測(cè)量3次，取平均值。

1.6.2 血漿SOD及MDA檢測(cè) 血漿總SOD活力及MDA含量的測(cè)定，按照試劑盒說明書操作。

1.6.3 滑膜組織及NF-κB、TNF-α的表達(dá) 取滑膜組織標(biāo)本切片常規(guī)脫蠟，3%H2O2室內(nèi)溫育10～15 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗3次。修復(fù)抗原，用BSA封閉，室溫10～15 min，傾去血清。滴加一抗，4℃過夜。PBS沖洗，5 min，3遍。滴加SP復(fù)合物37℃，30～40 min。再用PBS 沖洗，3 遍。PBS 4 ml、DAB 5 g、H2O25 μl，顯色 5 min左右 (以鏡下適度為好)。蒸餾水洗5次。蘇木精復(fù)染1 min，水洗，1%鹽酸酒精分化、脫水、透明、封固。鏡下觀察結(jié)果，胞質(zhì)黃色或棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。并測(cè)量出陽(yáng)性染色部位的積分光密度 (IOD)，代表該切片 NF-κB、TNF-α的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 依達(dá)拉奉對(duì)足墊厚度的影響 第0～12天關(guān)節(jié)腫脹無(wú)明顯變化，第15天大鼠足部及踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹，第18～28天關(guān)節(jié)紅腫及軟組織腫脹更加明顯。見表1。

2.2 依達(dá)拉奉對(duì)大鼠抗氧化能力的影響 見表2。模型組大鼠SOD較正常組降低，MDA升高(P＜0.01)，依達(dá)拉奉治療后，SOD、MDA 均有改善(P＜0.05，P＜0.01)。

表1 依達(dá)拉奉對(duì)大鼠右足墊厚度的影響(±s，mm，n=6)

表1 依達(dá)拉奉對(duì)大鼠右足墊厚度的影響(±s，mm，n=6)

與正常組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較:3)P＜0.05;4)P＜0.01;下表同

組別0 d 12 d 15 d 18 d 21 d 24 d 27 d正常組 4.92±0.08 5.07±0.08 5.13±0.10 5.16±0.08 5.20±0.11 5.25±0.10 5.28±0.08模型組 4.90±0.11 5.37±0.33 6.32±0.811)7.62±0.911)8.13±0.472)7.32±0.432)6.83±0.621)低劑量組 4.98±0.08 5.22±0.29 6.48±1.091)7.92±0.542)7.23±0.782)3)6.47±0.731)3)5.93±0.591)3)高劑量組 4.95±0.10 5.52±0.97 6.33±0.811)7.85±0.342)7.12±0.732)3)6.23±0.681)4)6.77±0.461)4)

表2 依達(dá)拉奉對(duì)大鼠抗氧化能力的影響(±s，n=6)

表2 依達(dá)拉奉對(duì)大鼠抗氧化能力的影響(±s，n=6)

組別 SOD(U/ml) MDA(μmol/ml)正常組432.58±25.35 7.13±0.72模型組 282.13±21.012)15.27±1.312)低劑量組 335.02±43.282)3)11.15±0.922)4)高劑量組 377.35±41.552)4)10.35±0.792)4)

2.3 依達(dá)拉奉對(duì)大鼠滑膜組織NF-κB、TNF-α表達(dá)的影響在CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中可見NF-κB(p65)、TNF-α陽(yáng)性染色分布于滑膜襯里細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及淋巴細(xì)胞中。胞質(zhì)及胞核內(nèi)均有染色，但胞核染色較深，多呈團(tuán)塊狀分布，而胞質(zhì)染色較淺。在正常組大鼠滑膜中，襯里細(xì)胞、滑膜下層的巨噬細(xì)胞及成纖維細(xì)胞有少量陽(yáng)性染色，但染色程度明顯弱于模型組及依達(dá)拉奉組。見圖1及表3。

2.4 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜的組織學(xué)觀察 正常組:大鼠滑膜及關(guān)節(jié)面未見病變，膝關(guān)節(jié)滑膜襯里層由1～2層滑膜細(xì)胞組成且部分不連續(xù)。滑膜襯里下層則為由脂肪細(xì)胞、少量成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞與少量血管組成的結(jié)締組織，滑膜組織無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原纖維。模型組大鼠第28天滑膜組織腫脹，滑膜上皮層增厚，滑膜細(xì)胞增大，數(shù)量增多，膝關(guān)節(jié)滑膜襯里層增生可達(dá)7～8層，滑膜襯里下層可見少量炎性細(xì)胞、浸潤(rùn)，并有少量的成纖維細(xì)胞及小血管生成。依達(dá)拉奉低高劑量組:上述病變均程度不同地較模型對(duì)照組為輕，主要表現(xiàn)為滑膜襯里層增生減少，少見血管翳的形成。見圖2。

表3 依達(dá)拉奉對(duì)大鼠滑膜組織NF-κB、TNF-α表達(dá)的影響(±s，μm2，n=6)

表3 依達(dá)拉奉對(duì)大鼠滑膜組織NF-κB、TNF-α表達(dá)的影響(±s，μm2，n=6)

組別 NF-κB TNF-α正常組181.18±37.84 174.87±7.30模型組 563.94±30.362)633.02±41.792)低劑量組 434.25±80.662)4)516.56±36.032)4)高劑量組 289.23±58.402)4)489.30±34.402)4)

圖1 各組大鼠滑膜組織NF-κB、TNF-α表達(dá)(IH，×400)

圖2 各組滑膜細(xì)胞(HE，×200)

3 討論

自由基在RA的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的作用〔3〕。NF-κB是能與多種基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上的κB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，并能促使基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)總稱?；罨腘F-κB能與DNA特定的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)和調(diào)節(jié)眾多參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子的表達(dá)〔2〕，這些細(xì)胞因子進(jìn)一步引起關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的關(guān)節(jié)滑膜增生，血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨變性壞死等等。近年來(lái)研究表明自由基充當(dāng)著NF-κB活性調(diào)節(jié)的第二信號(hào)，其通過對(duì)NF-κB活性的調(diào)節(jié)從而參與了多種途徑的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，控制著多種細(xì)胞因子的表達(dá)生成〔3〕。依達(dá)拉奉是目前唯一在臨床上使用的自由基清除劑，目前多用于腦缺血的治療，因此可以通過依達(dá)拉奉對(duì)自由基的清除作用及對(duì)機(jī)體抗氧化能力提高的作用緩解RA的癥狀和病情的發(fā)展。

本試驗(yàn)提示CIA大鼠自由基數(shù)量的增加及機(jī)體抗氧化能力的下降，并且炎性細(xì)胞因子也在增加。病理組織觀察滑膜襯里層增生，血管翳形成并有炎細(xì)胞浸潤(rùn)。而依達(dá)拉奉能有效清除自由基數(shù)量，提高機(jī)體抗氧化能力減少滑膜組織 NF-κB、TNF-α的表達(dá)，組織病理學(xué)也有明顯改善。

本實(shí)驗(yàn)表明依達(dá)拉奉對(duì)CIA大鼠有明顯的清除自由基及抗炎作用，延緩CIA大鼠病程進(jìn)展。這進(jìn)一步提示依達(dá)拉奉治療CIA大鼠的作用機(jī)制可能是通過對(duì)血漿中自由基的清除抑制、從而抑制NF-κB、TNF-α等復(fù)雜的炎性介質(zhì)環(huán)路。多途徑、多環(huán)節(jié)作用于機(jī)體而抑制炎癥刺激，減輕炎癥反應(yīng)，使各種炎性因子的合成減少而發(fā)揮治療作用。由于傳統(tǒng)的抗風(fēng)濕藥毒副作用大，而新型的生物制劑價(jià)格昂貴，依達(dá)拉奉就為臨床上治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供了一種新的思路。

1 韓曉楓，馬寶驪，張繼英，等.雞膠原Ⅱ型誘導(dǎo)大鼠類風(fēng)濕模型的建立〔J〕.上海免疫學(xué)雜志，2001;21(6):330-3.

2 姚茹冰.核因子κB與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)性的研究進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2006;19(3):267.

3 徐 康，林 正.自由基對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性的調(diào)節(jié)〔J〕.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2004;17(7):654-6.

〔2011-06-22收稿 2011-09-12修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)

R684.3

A

1005-9202(2012)17-3730-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.053

1 河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科

靳洪濤(1963-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事風(fēng)濕病的診斷治療。

齊 晅(1982-)，男，醫(yī)師，主要從事風(fēng)濕病的診斷治療。