王彥霞 籍文強 楊 濤 石玉珍趙紅敏 (河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院急診科，河北 石家莊 05008)

血管活性腸肽對慢性阻塞性肺病患者外周血單個核細胞分泌TNF-α和IL-8的影響

王彥霞 籍文強 楊 濤 石玉珍1趙紅敏 (河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院急診科，河北 石家莊 050081)

目的 觀察血管活性腸肽(VIP)對體外培養(yǎng)慢性阻塞性肺病(COPD)患者外周血單個核細胞(PBMC)產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-8(IL-8)水平的影響。方法 應(yīng)用不同濃度VIP預(yù)處理COPD緩解期患者PBMC，再以脂多糖(LPS)誘導(dǎo)，用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-8含量。結(jié)果 不同濃度VIP均能降低LPS誘導(dǎo)的PBMC產(chǎn)生TNF-α和IL-8，在10－8mol/L濃度最低。VIP可以降低COPD急性加重期治療前后有或無LPS誘導(dǎo)的PBMC產(chǎn)生TNF-α和IL-8含量。結(jié)論 VIP對COPD患者PBMC有直接抗炎作用。

慢性阻塞性肺病;腫瘤壞死因子-α;白介素-8;血管活性腸肽

血管活性腸肽(VIP)是肺內(nèi)含量最豐富的神經(jīng)肽類物質(zhì)之一，通過與其受體結(jié)合發(fā)揮廣泛的生物學(xué)調(diào)節(jié)作用。VIP作為配體，可以在人類激活的外周血單個核細胞(PBMC)中發(fā)現(xiàn)特異性受體，通過與細胞膜表面特異性受體結(jié)合發(fā)揮抗炎作用。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸系統(tǒng)最常見的老年慢性炎癥性疾病之一，PBMC參與其炎癥反應(yīng)過程。革蘭陰性桿菌感染是COPD急性加重的主要原因之一，而脂多糖(LPS)是革蘭陰性桿菌外膜的一種大分子物質(zhì)。本實驗采用COPD患者PBMC為研究對象進行體外培養(yǎng)，應(yīng)用VIP進行干預(yù)，通過測定PBMC產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF-α)和白介素-8(IL-8)的含量，探討其對COPD的抗炎作用。

1 資料與方法

1.1 對象 選定2009年10月至2011年6月河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院急診科及呼吸內(nèi)科病房住院的COPD急性加重期患者為治療前組，入院后經(jīng)過積極治療后病情好轉(zhuǎn)達到穩(wěn)定期的為治療后組，年齡55～80〔平均(67.7±6.2)〕歲。病情惡化或死亡者被排除。COPD緩解期組來源于同期來我院門診復(fù)診的患者。以上病例均符合2007年COPD診治指南修訂版〔1〕，并排除心腦血管系統(tǒng)的所有疾病、呼吸系統(tǒng)其他疾病、較嚴重的消化系統(tǒng)疾病、腎病、糖尿病等內(nèi)分泌代謝疾病、腫瘤以及重大手術(shù)和結(jié)締組織病等。

1.2 方法

1.2.1 收集PBMC 取試驗對象空腹無菌靜脈血(肝素抗凝)，用等體積的0.9%氯化鈉注射液稀釋抗凝管中的血液，充分混勻。取等體積淋巴細胞分離液加入10 ml無菌離心管中，將上述稀釋的血液沿離心管壁緩緩平鋪在淋巴細胞分離液面上層，保持兩液間界限分明。4℃離心(2 000 r/min，25 min)，吸取血漿與分離交接面白色云霧狀層的單個核細胞，并將其移至另一10 ml無菌離心管中，加5倍體積的0.9%氯化鈉注射液稀釋，充分混勻，4℃離心(1 000 r/min，10 min)，傾去上清液，輕輕彈起細胞沉淀，再加5倍體積的0.9%氯化鈉注射液稀釋，并充分混勻，4℃離心(1 000 r/min，10 min)，盡量去掉上清液，底層為單個核細胞。0.4%臺盼藍染色，排除無活性的細胞，活細胞數(shù)＞90%可采用。淋巴細胞分離液由北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司提供。

1.2.2 試驗分組 取6例COPD緩解期患者外周血分離出的單個核細胞，用無血清1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細胞濃度均為2.0×106個/ml。細胞種于48孔培養(yǎng)板中。每份單個核細胞按VIP劑量分為若干組，每組種3孔，取其平均值。不同劑量的VIP培養(yǎng)30 min后，加入終濃度為1 mg/L的LPS進行刺激。另外，將每例治療前后COPD患者PBMC平均分成4組，分別為空白對照組、VIP組、LPS組和 LPS+VIP組，VIP終濃度為10－8mol/L。取等體積的每組細胞分別培養(yǎng)30 min后，需用LPS刺激的細胞培養(yǎng)液體中加入終濃度為1 mg/L的LPS，于37℃、5%CO2、95% ～100%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)8 h，取上清液于－70℃冰箱凍存，待測繼續(xù)培養(yǎng)(RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，VIP、LPS由美國Sigma公司提供)。

1.3 檢測TNF-α、IL-8水平 用ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-8的含量。TNF-α和IL-8的ELISA試劑盒均購自深圳晶美公司，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，各計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(One way ANOVY)，如差異有顯著性進一步用 Student-Newman-Keuls(SNK-q)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 VIP干預(yù)COPD緩解期PBMC分泌TNF-α、IL-8的影響VIP能明顯降低LPS誘導(dǎo)下的COPD緩解期 PBMC分泌的TNF-α和IL-8(P＜0.05)。隨著 VIP劑量的增加，TNF、IL-8的含量降低越來越明顯，當 VIP濃度為10－8mol/L時，TNF-α、IL-8的含量到達最低，隨后逐漸升高，但均低于LPS+0 mol/L(P＜0.05)。見表1。

2.2 VIP干預(yù)不同條件下COPD急性加重期治療前后PBMC分泌TNF-α、IL-8的影響 VIP能夠降低COPD急性加重期治療前后PBMC分泌TNF-α和IL-8的含量(P＜0.05);LPS可以上調(diào)COPD急性加重期治療前后PBMC分泌TNF和IL-8的含量(P＜0.05);VIP對LPS誘導(dǎo)的COPD急性加重期治療前后PBMC分泌TNF-α和 IL-8的含量同樣具有抑制作用(P＜0.05)。見表2。

表1 不同濃度VIP對COPD穩(wěn)定期PBMC分泌TNF-α、IL-8 的影響(±s，n=6，mg/ml)

表1 不同濃度VIP對COPD穩(wěn)定期PBMC分泌TNF-α、IL-8 的影響(±s，n=6，mg/ml)

與LPS+0 mol/L VIP組比較:1)P＜0.05

組別 TNF-αIL-8 LPS+0 mol/L VIP組49.92±6.71 43.16±6.85 LPS+10－9mol/L VIP組 41.66±5.961)36.86±2.581)LPS+10－8mol/L VIP組 40.63±5.461)36.40±3.561)LPS+10－7mol/L VIP組 40.64±5.521)36.75±2.491)LPS+10－6mol/L VIP組 40.73±6.171)38.14±2.411)

表2 VIP干預(yù)不同條件下COPD治療前后PBMC分泌TNF-α、IL-8 的影響(±s，n=20，pg/ml)

表2 VIP干預(yù)不同條件下COPD治療前后PBMC分泌TNF-α、IL-8 的影響(±s，n=20，pg/ml)

與空白對照組比較:1)P＜0.05;與LPS組比較:2)P＜0.05

組別 TNF-αIL-8 COPD治療前 空白對照組46.16±5.49 39.59±3.60 VIP組 42.47±6.031)36.96±4.311)LPS組 52.59±6.65 45.59±4.14 LPS+VIP組 48.38±6.372)42.01±4.082)COPD治療后 空白對照組 42.90±4.84 36.62±3.75 VIP組 38.19±5.411)33.57±3.971)LPS組 48.32±5.39 41.19±4.08 LPS+VIP組 43.95±5.372)36.92±4.182)

3 討論

多種炎性細胞、炎癥介質(zhì)和細胞因子參與了COPD的慢性氣道炎癥反應(yīng)，支氣管肺組織炎癥、損傷、修復(fù)和重塑是其病情不斷進展的病理發(fā)展過程。TNF-α是早期炎癥反應(yīng)的啟動因子，能激活炎性細胞，尤其是巨噬細胞和中性粒細胞，使其細胞毒性增加，可以刺激其釋放更多的氧和氮基團以及其他細胞因子〔2〕，形成炎癥級聯(lián)反應(yīng)。Gallelli等〔3〕應(yīng)用 TNF-α 誘導(dǎo)支氣管上皮細胞，發(fā)現(xiàn)IL-8含量較前明顯增高?？梢奣NF-α能夠促進炎性介質(zhì)分泌，擴大氣道的炎癥反應(yīng)。而且，TNF-α能增強中性粒細胞的細胞外蛋白分解作用，刺激氣道細胞增殖，誘導(dǎo)氣道黏液細胞化生，激活炎癥介質(zhì)等氣道炎癥和重塑，是COPD氣流受限的主要原因之一。多方面研究顯示:COPD患者不同階段血漿、誘導(dǎo)痰、肺泡灌洗液中IL-8含量存在明顯差異，并且明顯高于正常對照組〔4，5〕，提示 IL-8是促進 COPD氣道炎癥反應(yīng)持續(xù)發(fā)展的重要因子之一，而且貫穿于COPD氣道炎癥反應(yīng)過程的始終，發(fā)揮引發(fā)維持甚至加重氣道炎癥的重要作用。TNF-α和 IL-8在炎癥反應(yīng)中相互促進、相互調(diào)節(jié)。COPD急性加重期血清及痰液中的TNF-α和IL-8同步升高，且呈顯著正相關(guān)，說明兩者協(xié)同作用共同參與COPD的氣道炎癥反應(yīng)過程。抑制TNF-α和IL-8的分泌，可能是阻止COPD炎癥反應(yīng)的重要手段之一。

VIP是由28個氨基酸組成的直鏈肽，屬于胰高血糖素促胰島素家族〔2〕，通過分布于肺血管平滑肌、氣道平滑肌、氣道上皮層、黏膜下的腺體、巨噬細胞、肺泡上皮和淋巴細胞等的受體而發(fā)揮抗炎作用。國外研究者在人的肺泡巨噬細胞表面發(fā)現(xiàn)有VIP受體表達，并證明VIP能下調(diào)IL-8的分泌〔6〕，對TNF-α分泌也有一定的抑制作用〔7〕。本實驗證明，VIP可以抑制COPD患者PBMC分泌TNF-α和IL-8，并存在一定的量效關(guān)系。

VIP對炎性因子的調(diào)節(jié)作用屬于轉(zhuǎn)錄水平，通過限制多種轉(zhuǎn)錄因子的重新表達或核遷移，使促炎因子的mRNA及合成的蛋白水平降低。涉及兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑:①cAMP依賴途徑，即通過抑制促炎因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CBP)的合成〔8〕，降低促炎因子mRNA的合成。②cAMP非依賴途徑，即VIP通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB的活性，從而阻止NF-κB核移位和與DNA的結(jié)合，優(yōu)先阻止炎性介質(zhì)基因啟動區(qū)與NF-κB位點的結(jié)合，減少炎性介質(zhì)的合成，通過相反機制提高抗炎因子IL-10 mRNA 和蛋白水平〔9〕。

VIP對COPD患者PBMC有一定的抗炎作用，但僅靠體內(nèi)已有的VIP不足以發(fā)揮其應(yīng)有的生物學(xué)作用，適量補充VIP或VIP類似物不乏是治療COPD的一種有效方法。

1 中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)會分會慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007年修訂版)〔J〕.中華結(jié)核和呼吸雜志，2007;30(1):8-17.

2 Scheele I，Larsson K，Palmberg L.Budesonide enhances Toll-like receptor2 expression in activated bronchial epithelial cells〔J〕.Inhal Toxicol，2010;22(6):493-9.

3 Gallelli L，Pelaia G，F(xiàn)ratto D，et al.Effects of budesonide on P38 MAPK activation，apoptosis and IL-8 secretion，induced by TNF-alpha and Haemophilus influenzae in human bronchial epithelial cells〔J〕.Int Immunopathol Pharmacol，2010;23(2):471-9.

4 姚海燕，吳大瑋.慢性阻塞性肺疾病患者誘導(dǎo)痰IL-8、TNF-a水平和炎癥細胞的分布〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2007;27(14):1366-9.

5 王春雷，蔡日丹，康 健，等.慢性阻塞性肺病患者細胞因子與氧自由基的相關(guān)性〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2010;30(3):310-2.

6 Burian B，Storka A，Marzluf BA，et al.Vasoactive intestinal peptide(VIP)receptor expression in monocyte-derived macrophages from COPD patients〔J〕.Peptides，2010;31(4)603-8.

7 張海紅，劉先洲，饒幫忠，等.血管活性腸肽對肺炎支原體誘導(dǎo)的人肺上皮細胞分泌TNF-α的影響〔J〕.武漢大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2008;29(6)747-50.

8 Delgado M，Ganea D.Vasoactive intestinal peptide inhibits IL-8 production in human monocytes〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2003;301(4):825-32.

9 Catley MC，Sukkar MB，Chung KF，et al.Validation of the anti-inflammatory properties of small-molecule I kappaB Kinase(IKK)-2 inhibitors by comparison with adenoviral-mediated delivery of dominant-negative IKK1 and IKK2 in human airways smooth muscle〔J〕.Mol Pharmacol，2006;70(2):697-705.

〔2012-01-26收稿 2012-03-20修回〕

(編輯 袁左鳴)

R56

A

1005-9202(2012)17-3684-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.032

1 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科

王彥霞(1971-)，女，主治醫(yī)師，主要從事慢性阻塞性肺病的臨床研究。