崔小華，楊素萍，姚鵬

（1.山西大學 生命科學學院，山西 太原030006；2.華僑大學 生物工程與技術(shù)系，福建 廈門361021；3.山西中醫(yī)學院 中西醫(yī)結(jié)合臨床醫(yī)學系，山西 太原030024）

紫色硫細菌是不產(chǎn)氧光合細菌中一個特殊的生理類群，屬于Proteobacteria門、Gammaproteobacteria綱、Chromatiales目，有 Chromatiaceae和 Ectothiorhodospiraceae兩個科［1］。它們大約出現(xiàn)在3.5Ga年前，生活在富含硫化物光照厭氧的環(huán)境中，能利用N2、H2S、H2、CO2和 NH3等原始大氣成分和太陽能進行不產(chǎn)氧的光能無機自養(yǎng)生長，也能利用有機物作為電子供體進行光能異養(yǎng)或化能異養(yǎng)生長，對其進行深入研究對于探索生命起源和地球進化、自然界碳、氮、硫物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化有重要的理論意義［2～4］。生產(chǎn)實踐中，紫色硫細菌因其特殊的生境和生理特點，在廢水處理、生產(chǎn)養(yǎng)殖、天然色素等方面有著廣闊應用前景，尤其是它們能耐受高濃度的硫化物，在處理含有高濃度硫化物廢水中發(fā)揮著重要作用［5］。本實驗室分離到一株含奧氏酮、耐高濃度硫化物、嗜鹽、耐堿紫色硫細菌菌株283－1，該菌株能氧化硫化物產(chǎn)生硫粒儲存在細胞內(nèi)，而且能以亞硝酸鹽作為唯一氮源，細胞含有奧氏酮類胡蘿卜素和強吸收峰位于830nm處的細菌葉綠素a［6］，對其光合作用元件，耐鹽機理和去除碳、氮、磷和有毒物質(zhì)硫化物進行深入研究對于探索光合作用機理、抗逆機制和耐鹽機理和水質(zhì)凈化具有重要的理論意義和應用價值。但該菌株生長速率慢，周期長且菌體的生物量較低，難以滿足理論研究和實際應用的要求。因此，本實驗選擇了響應面設(shè)計法，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過Plackett－Burman設(shè)計篩選出對菌體生物量具有顯著影響作用的因子，然后通過最陡爬坡試驗，確定接近顯著因子最佳響應濃度，最后采用中心組合試驗設(shè)計篩選顯著因子的最優(yōu)水平，以期得到最優(yōu)培養(yǎng)基配方提高生物量，為菌株283－1的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

紫色硫細菌 Marichromatiunsp.283－1，Gen－Bank登錄號為EU057602，本實驗室從青島鹽池鹵水中分離、鑒定并保存。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

菌種培養(yǎng)采用Pfennig紫色硫細菌培養(yǎng)基［7］。接種量為3%，培養(yǎng)條件為2500lux，30℃，光照厭氧，靜止培養(yǎng)5天。

1.3 生物量的測定

采用比濁法，以660nm吸光度（OD660）表示生物量。取適量培養(yǎng)液用紫外可見分光光度計測定OD660。

1.4 單因素試驗

在Pfennig紫色硫細菌培養(yǎng)基中添加乙酸鈉，采用單因素優(yōu)化法，以菌體生物量為指標，優(yōu)化了乙酸鈉，碳酸氫鈉、氯化銨、硫化鈉、硫酸鎂、無機鹽6個因子。

1.5 Plackett－Burman試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用2水平設(shè)計，對單因素試驗選取的6個因素，進行12次試驗，篩選顯著影響因子。選取的因素、水平和試驗設(shè)計見表1和表2。

表1 Plackett－Burman試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett－Burman

表2 Plackett－Burman試驗Table 2 Results of Plackett－Burman design

1.6 最陡爬坡試驗

對1.5篩選出的顯著因子，根據(jù)Plackett－Burman試驗結(jié)果擬合的一階模型方程的系數(shù)設(shè)計最陡爬坡的步長，以坡的最高點作為后續(xù)中心組合的中心點。

1.7 響應面分析

由最陡爬坡試驗逼近最大響應區(qū)域后，采用中心組合設(shè)計法對其進行進一步優(yōu)化。數(shù)據(jù)用統(tǒng)計分析軟件Design－Expert分析，對得到的理論最高點做3次重復驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

經(jīng)過單因素試驗，無機鹽溶液、硫酸鎂、碳酸氫鈉、氯化銨、硫化鈉和乙酸鈉的含量分別為1mL·L－1、0.5g·L－1、0.75g·L－1、4.5g·L－1、1g·L－1和1.5g·L－1時，培養(yǎng)菌懸液OD660最高，分別為0.68、0.70、0.80、0.80、1.00和1.80。以Pfennig培養(yǎng)基為對照，培養(yǎng)液OD660為0.45。根據(jù)單因子優(yōu)化的結(jié)果來設(shè)計Packett－Burman試驗各因子的水平。

2.2 Plackett－Burman試驗

各因子對菌體生物量影響的方差分析見表3。結(jié)果表明，6個因子對菌體生物量的影響有所不同，影響順序為乙酸鈉＞硫化鈉＞無機鹽＞碳酸氫鈉＞硫酸鎂＞氯化銨，其中乙酸鈉（A）和硫化鈉（F）在95%置信區(qū)間呈顯著影響。經(jīng)過擬合，各因素的效應良好地符合一階模型方程，Y＝1.25＋0.23A－0.033B＋0.008D＋0.19F－0.014H－0.063J，R2＝0.9407。

表3 因素的效應分析Table 3 Analysisof factors effect

2.3 最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett－Burman試驗選擇顯著因子進行最陡爬坡試驗。A（乙酸鈉）和F（硫化鈉）的濃度見表4，其他因子對生物量沒有顯著影響，因此選擇2.1單因素試驗優(yōu)化的因子濃度。由表4可知，A和F的最優(yōu)濃度在第3處理附近，因此選擇A（乙酸鈉）濃度1.5g·L－1，F(xiàn)（硫化鈉）濃度1.0g·L－1作為響應面試驗的中心點。

表4 最陡爬坡試驗的設(shè)計及結(jié)果Table 4 Design and results of the steepest ascent experiment

2.4 中心組合設(shè)計和響應面分析

根據(jù)爬坡試驗得到的中心點，對因子A和F進行中心組合設(shè)計試驗，為使擬合方程具有旋轉(zhuǎn)性和通用性，中心點重復5次，星號臂長為1.414，見表5。測定結(jié)果見表6。利用Design－Expert軟件對表6數(shù)據(jù)分析，獲得回歸方程Y＝3.28－0.077A ＋0.089F ＋0.10AF －0.34A2－0.30 F2，其中Y為 OD660，R2＝0.9636?；貧w模型的方差分析見表7，表明該回歸模型高度顯著（p＜0.0001），失擬項不顯著，擬合方程的二次項、一次項和交互項都具有顯著差異，表明A和F這兩個因子對生物量的影響有交互作用。

表5 中心組合試驗的因子和水平Table 5 Factors and levels for central composite experiment

表6 中心組合試驗設(shè)計及響應值表Table 6 Result and design table ofcentral composite experiment

表7 回歸模型方差分析Table 7 ANOVA for the response surface experiment

回歸方程繪制的響應曲面見圖1，拋物面開口向下，曲面有最大值。擬合方程的極值點，即為A和F的最佳濃度，經(jīng)偏導求解A和F數(shù)值分別為1.45g·L－1和1.05g·L－1，對應理論最大生物量（OD660）為3.28。

圖1 響應面立體圖Fig.1 Response surface plot

2.5 優(yōu)化培養(yǎng)基的驗證

優(yōu)化的培養(yǎng)基和初始培養(yǎng)基培養(yǎng)的生長曲線見圖2，與初始培養(yǎng)基相比，在優(yōu)化培養(yǎng)基中，菌體生長沒有明顯的延滯期，生長速率提高，最大生物量OD660達到3.12，與回歸方程預測值（3.28）基本一致，生物量提高了6倍以上。

3 結(jié)論與討論

響應面分析法因試驗次數(shù)少、周期短，求得的回歸方程精確度高，并且可以研究幾個因素之間的交互作用，因此是優(yōu)化培養(yǎng)基組分的一種有效方法。近年來該方法已廣泛應用于各種培養(yǎng)基組分以及發(fā)酵條件的優(yōu)化［8～10］。經(jīng)過單因素試驗，Plackett－Burman試驗，最陡爬坡試驗，中心組合設(shè)計和響應面分析，獲得了最佳的培養(yǎng)基配方：乙酸鈉1.45g·L－1，碳酸氫鈉0.75g·L－1，氯化銨4.5g·L－1，硫酸鎂0.5g·L－1，硫化鈉1.05g·L－1，氯化鈣0.19g·L－1，氯化鉀0.34g·L－1，氯化鈉50g·L－1，VB1220μg·L－1，無機鹽溶液1mL·L－1。與初始Pfennig紫色硫細菌培養(yǎng)基［7］相比，潛伏期縮短，生長速率加快，生物量明顯提高。因此，基于響應面設(shè)計法得到的優(yōu)化培養(yǎng)基配方準確可靠，為嗜鹽紫色硫細菌283－1的理論研究和實際應用奠定了基礎(chǔ)。

圖2 菌株283－1培養(yǎng)基優(yōu)化前（a）后（b）的生長比較Fig.2 The growth of strain 283－1compared before and after optimization

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