李鳳美，周永斌，訾惠君，劉連強(qiáng)

（天津市林業(yè)果樹研究所，天津 300384）

食用菌菌種的包埋是指采用物理方法，將食用菌菌絲體包裹在凝膠的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)中或半透性聚合薄膜內(nèi)，使其保持活性并可反復(fù)使用的一種技術(shù)。包埋法操作簡單，條件溫和，包埋后的微環(huán)境相對(duì)封閉，是目前固定化技術(shù)中最有效和實(shí)用的一類方法。被包埋的菌種常常用于液體發(fā)酵上，生產(chǎn)初級(jí)或次級(jí)代謝產(chǎn)物，有關(guān)研究顯示食用菌菌絲體包埋后，相比游離細(xì)胞不僅延長了菌種的應(yīng)用時(shí)間，且發(fā)酵得到的目標(biāo)產(chǎn)物均有小幅提高[1-3]。

包埋載體的選擇是包埋技術(shù)中十分關(guān)鍵的一步，所選擇的載體應(yīng)無毒，不影響細(xì)胞代謝，有一定的保水性，成本低，有較高的細(xì)胞負(fù)載量和活性[4]。本實(shí)驗(yàn)選取不同的載體材料對(duì)食用菌菌種進(jìn)行固定化包埋，通過比較載體的機(jī)械強(qiáng)度、操作難易、有無毒害、菌株復(fù)水活化情況等選出適合的載體，并對(duì)包埋劑的濃度、成分配比等進(jìn)行試驗(yàn)研究，從而確定最適的包埋條件。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌種

所用菌種為本實(shí)驗(yàn)室自有的平菇、靈芝、杏鮑菇菌種。

1.2 培養(yǎng)基

PDA綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮200 g（加水煮沸20 min，過濾取汁）、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g，水1 000 mL，pH值5.8~6.2。分裝，0.1 MPa滅菌20 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

海藻酸鈉（SA）、聚乙烯醇（PVA）、卡拉膠、明膠、丙烯酰胺單體、N，N'－亞甲基雙丙烯酰胺（BIS）、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸鉀（K2S2O8）、二醋酸纖維素、2%氯化鈣溶液（121℃滅菌30 min）、4%硼酸溶液（121℃滅菌30 min）、丙酮，以上化學(xué)試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌絲體細(xì)胞懸浮液的制備方法

制備PDA液體培養(yǎng)基，分裝后121℃滅菌30 min，冷卻。各取一小塊食用菌母種接種于液體培養(yǎng)基上，25℃搖床上培養(yǎng)15 d，將得到的菌絲體小球用無菌水沖洗、過濾、碾磨，加少量的無菌水制成懸浮液。

2.2 菌種包埋方法

2.2.1 海藻酸鈉（SA） 包埋

加熱制備3%的海藻酸鈉溶液，冷卻到40℃后加入少量菌體細(xì)胞懸浮液，用針管滴入到2%的氯化鈣溶液中，靜置3 h～4 h完全硬化，用無菌水洗凈制得海藻酸鈉包埋小珠。

2.2.2 明膠包埋

加熱制備質(zhì)量濃度為10%的明膠溶液，冷卻到40℃后加入少量菌體細(xì)胞懸浮液混勻，倒培養(yǎng)皿中鋪平板，待其冷卻凝固后切成邊長4 mm～5 mm的方塊。

2.2.3 卡拉膠包埋

加熱制備質(zhì)量濃度為2%的卡拉膠溶液，冷卻到40℃后加入少量菌體細(xì)胞懸浮液混勻，倒入培養(yǎng)皿中鋪平板，待其冷卻凝固后切成邊長4 mm～5 mm的方塊。

2.2.4 醋酸纖維素包埋

取1 g二醋酸纖維素加到15 mL丙酮中，攪拌使之溶解，加入少量菌體細(xì)胞懸浮液混勻，用針管滴入無菌水中，形成珠體。

2.2.5 聚丙烯酰胺凝膠包埋

將少量丙烯酰胺單體和N，N'－亞甲基雙丙烯酰胺（BIS）溶于水；將菌體細(xì)胞懸浮液加入上述混合液中，攪拌均勻；在上述溶液中，加入四甲基乙二胺（TEMED）和過硫酸鉀（K2S2O8），室溫下放置30 min，使之聚合完全，得到聚丙烯酰胺凝膠；將上述凝膠切成邊長4 mm～5 mm的方塊，用生理鹽水洗凈，備用。

2.2.6 聚乙烯醇（PVA） 包埋

將PVA加熱溶于水，制備質(zhì)量濃度為10%的PVA溶液，冷卻至40℃后加入少量菌體細(xì)胞懸浮液混勻，用針管滴入到4%的硼酸溶液中，靜置12 h硬化，取出后用無菌水沖洗備用。

2.3 包埋載體的強(qiáng)度測試

兩塊載玻片之間放置粒徑相近的包埋小球，在上面的載玻片上加100 g砝碼，觀察小球外形有無變化，看是否有裂痕，是否被壓碎來表征小球的機(jī)械強(qiáng)度。

2.4 包埋菌株的復(fù)水活化試驗(yàn)

將包埋菌種接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)7 d～10 d，對(duì)比觀察不同材料包埋菌種的成活情況及菌絲萌發(fā)情況。

2.5 包埋載體的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

將聚乙烯醇加熱溶于水，制備質(zhì)量濃度分別為8%、9%、10%的溶液，向上述溶液中分別加入不等量的海藻酸鈉，使得海藻酸鈉的質(zhì)量濃度分別為0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%，攪拌均勻，待混合溶液冷卻至40℃后加少量菌體細(xì)胞懸浮液，將混合液用針管滴入到硬化劑中，硬化劑為2%氯化鈣與4%硼酸的混合液，靜置10 h，取出，用無菌水沖洗備用。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

3.1 各種載體材料制備包埋菌種的難易情況及表觀特征

不同載體制備包埋菌種的難易情況以及表觀特征見表1。

表1 不同載體制備包埋菌種的難易情況及表觀特征

由表1可知，采用海藻酸鈉、明膠、卡拉膠作載體包埋菌種，復(fù)水活化后，菌株成活率都在85%以上。但明膠和卡拉膠的機(jī)械強(qiáng)度較低，顆粒極易破碎使得被包埋細(xì)胞泄出，并且明膠切塊時(shí)易粘連，不容易操作，卡拉膠雖然不粘連但機(jī)械強(qiáng)度太低，因此這2種材料都不適合作菌株包埋的載體。

采用醋酸纖維素和聚丙烯酰胺作載體，雖然包埋顆粒的機(jī)械強(qiáng)度高，化學(xué)性能穩(wěn)定，但是菌株復(fù)水活化后成活率太低，其原因可能是醋酸纖維素中添加的丙酮對(duì)菌株細(xì)胞有毒害，而丙烯酰胺單體在形成聚合物網(wǎng)絡(luò)時(shí)，形成條件比較劇烈，對(duì)微生物細(xì)胞的損害較大。因此這兩種材料也都不適合作菌株包埋的載體。

采用海藻酸鈉作載體，成球容易，小球形狀較為規(guī)則，制備操作較為容易，菌株復(fù)水后成活率較高，缺點(diǎn)是海藻酸鈉機(jī)械強(qiáng)度不高。由于海藻酸鈉無毒，其溶膠、凝膠過程比較溫和，且生物相容性良好，因此常用于作包埋藥物、細(xì)胞、蛋白的微膠囊載體。

采用聚乙烯醇作載體，其機(jī)械強(qiáng)度很高，用100 g砝碼擠壓被包埋小球，小球外形基本無變化，且對(duì)微生物無毒，菌株復(fù)水后成活率達(dá)80%。存在的問題是聚乙烯醇質(zhì)量濃度低時(shí)無法凝集成球，濃度高時(shí)雖能成球，但極易粘連，被包埋小球拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重。聚乙烯醇是一種新型的微生物包埋固定化載體，它具有機(jī)械強(qiáng)度高、化學(xué)穩(wěn)定性好、抗微生物分解性能強(qiáng)、對(duì)微生物無毒、價(jià)格低廉等一系列優(yōu)點(diǎn)，近年來在國內(nèi)外獲得了較廣泛的研究[5，6]。

綜上可知海藻酸鈉和聚乙烯醇兩種材料適于做菌種包埋的載體，且兩種材料的優(yōu)勢互補(bǔ)，因此可將二者以一定比例混合，進(jìn)行優(yōu)化配比，來提高包埋菌種的機(jī)械強(qiáng)度，防止粘連，使操作變得容易。

3.2 包埋載體的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

PVA-SA混合法制備包埋菌種的操作情況見表2。

從表2中可知，以聚乙烯醇PVA為包埋劑，添加適量的海藻酸鈉SA，可防止粘連現(xiàn)象發(fā)生，利于載體成球。海藻酸鈉的添加量在0.8%最好，不僅促進(jìn)成球且無粘連。隨著海藻酸鈉含量的增加，過多的海藻酸鈉反而會(huì)使載體溶劑黏度增大，粘連現(xiàn)象加劇，固化操作困難，因此選擇海藻酸鈉SA添加量為0.8%，聚乙烯醇PVA的濃度在10%時(shí)，成球較易，球形狀規(guī)則，無粘連，易操作。

表2 PVA-SA混合法制備包埋菌種的操作情況

實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)由于海藻酸鈉與聚乙烯醇二者均為親水性的聚合物，互溶性好，混合制得的材料彈性和柔韌性明顯優(yōu)于單體。同時(shí)，海藻酸鈉作為一種多糖類天然高分子化合物，對(duì)微生物細(xì)胞起一定的保護(hù)作用，它的引入減輕了硼酸對(duì)微生物細(xì)胞的毒性作用，提高了固定化細(xì)胞的相對(duì)活性。

綜上選擇10%聚乙烯醇并添加0.8%海藻酸鈉作為包埋載體，進(jìn)行食用菌菌種包埋，硬化劑為2%氯化鈣與4%硼酸的混合液。

4 結(jié)論

用海藻酸鈉、聚乙烯醇、卡拉膠、明膠、醋酸纖維素和聚丙烯酰胺作載體，分別對(duì)食用菌（以平菇、靈芝、杏鮑菇為代表）菌種進(jìn)行包埋實(shí)驗(yàn)。通過對(duì)載體機(jī)械強(qiáng)度、操作難易情況、固定化細(xì)胞活性進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，海藻酸鈉和聚乙烯醇兩種材料適合作包埋載體，由于二者優(yōu)勢互補(bǔ)，因此將兩種材料混合進(jìn)行優(yōu)化配比實(shí)驗(yàn)，最終確定以10%聚乙烯醇添加0.8%海藻酸鈉為包埋劑，對(duì)菌株進(jìn)行包埋，而后滴入2%氯化鈣與4%硼酸的混合液進(jìn)行硬化，可制得固定化菌種。

[1]尚德靜.固定化猴頭菌細(xì)胞的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，28(1)：31-33.

[2]孫亦陽.姬松茸的海綿固定化培養(yǎng)研究[J].廣州食品工業(yè)科技，2004，20(4)：28-30.

[3]邢小黑，孔小龍.香菇的海綿固定化培養(yǎng)研究[J].食用菌，2001(1)：8-9.

[4]武春艷.兩種載體固定化白腐真菌的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)及性能比較[J].工業(yè)水處理，2011，31(6)：32-35.

[5]姚晶晶.白腐真菌包埋技術(shù)研究[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，39(6)：101-105.

[6]劉建紅.海藻酸鈉、聚乙烯醇包埋固定化技術(shù)對(duì)紫色非硫光合細(xì)菌脫氫酶活性影響的試驗(yàn)研究[J].安全與環(huán)境工程，2009，16(3)：54-56.