王百樂，虞泓，曾文波，趙舒涵，楊俊媛，陳自宏

（云南大學中草藥生物資源研究所云百草實驗室昆明650091）

蛹蟲草與冬蟲夏草同屬不同種，在化學成分與功效上十分相似，可作為冬蟲夏草的有力替代品[2~5]。

冬蟲夏草主要分布于我國西藏、甘肅、青海、云南等地[9]，而蛹蟲草在全球分布廣泛[10]，在我國主要分布于湖北、河北、吉林、陜西、安徽、云南、廣西、貴州、四川、臺灣等省區(qū)[9]，在云南滇中、滇東南、滇西南、滇西、滇西北等地區(qū)均有蛹蟲草分布記載[11]。由于過渡挖掘和生態(tài)環(huán)境的破壞，野生冬蟲夏草資源接近枯竭，而冬蟲夏草的人工種植至今尚未取得突破性進展。與冬蟲夏草同屬的蛹蟲草作為蟲草屬真菌的模式種，在90年代初人工種植就取得了成功[12-13]。目前，蛹蟲草人工培養(yǎng)技術已經(jīng)十分成熟，遼寧、云南、貴州等地已實現(xiàn)人工蛹蟲草培養(yǎng)的產(chǎn)業(yè)化，一定程度解決了野生冬蟲夏草資源匱乏，價格昂貴的問題。

目前，國內(nèi)對野生蛹蟲草或野生蛹蟲草分離所得菌株人工培養(yǎng)菌絲體、子實體的化學活性成分、藥效藥理研究較多，但研究對象主要是產(chǎn)自我國北方溫帶地區(qū)[14-17]，楊鐘林等[18]對產(chǎn)自云南中部地區(qū)野生蛹蟲草生物學及其生態(tài)學習性進行了初步研究，而關于云南亞熱帶地區(qū)蛹蟲草菌株化學活性成分和藥效藥理，迄今為止尚未見研究報道。本試驗就是以采自云南中部地區(qū)野生蛹蟲草和人工培養(yǎng)蛹蟲草子實體分離得到的菌株為主要材料，對其在人工栽培條件下菌絲體的蟲草多糖和蟲草酸含量進行測定分析，以野生蛹蟲草和冬蟲夏草為對比。通過比較其差異，探討不同居群蛹蟲草在不同地理環(huán)境下活性成分含量差異可能存在的原因。通過對菌株間多糖、蟲草酸含量的比較，篩選出多糖、蟲草酸含量高的優(yōu)質(zhì)菌株，為今后的生產(chǎn)提供更為優(yōu)質(zhì)的菌株。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗材料為從云南和遼寧獲得的8個居群蛹蟲草菌種分離得到的72株菌株在本實驗室培養(yǎng)得到的菌絲體，以野生蛹蟲草和冬蟲夏草為對比，見表1。

表1 試驗材料

1.2 試驗儀器

電子天平，生化培養(yǎng)箱，控溫搖床，電熱恒溫水槽，電熱恒溫水浴鍋，艾柯超純水機，漩渦混合器，紫外分光光度計，電動離心機，循環(huán)水式真空泵，電熱鼓風干燥箱，高速萬能粉碎機。

1.3 試驗試劑

醋酸銨、冰醋酸、乙酰丙酮、高碘酸鉀、濃硫酸、鹽酸、無水乙醇、苯酚等均為國產(chǎn)分析純，L-鼠李糖為國藥集團化學試劑有限公司進口分裝，標準品甘露醇購自中國藥品生物制品檢定所，葡聚糖Dextran-40購自BIO BASIC INC，水為蒸餾水。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品制備

將已從新鮮蟲草樣品的菌核或子實體中分離出的蛹蟲草菌株在固體PPDA培養(yǎng)基 （1%蛋白胨+PDA）平皿中25℃活化培養(yǎng)5 d，取1 cm2大小的菌塊放入含100 mL無菌液體PPDA培養(yǎng)基的三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為120 r·min-1的搖床上25℃恒溫搖菌培養(yǎng)10 d，再靜止培養(yǎng)20 d，將三角瓶中的菌絲體取出于40℃恒溫干燥，然后用高速粉碎機粉碎至80目細度待用。對照用的野生蛹蟲草和冬蟲夏草經(jīng)40℃恒溫干燥后用高速粉碎機粉碎至80目細度待用。

1.4.2 蟲草多糖測定方法--苯酚-硫酸法[19]

樣品多糖含量測定：稱取樣品0.2500 g，加蒸餾水30 mL，熱回流2 h后趁熱抽濾，用蒸餾水洗殘渣，將濾液、洗液合并，定容至50 mL。量取定容好的溶液20 mL，置于揮發(fā)皿中揮干。將揮發(fā)后剩余物用1 mL蒸餾水溶解置于10 mL離心管中，加5 mL無水乙醇，混勻，置于離心機中4 000 r·min-1離心15 min，棄上清液。沉淀物加蒸餾水、無水乙醇及離心過程再重復2次。然后取沉淀物用蒸餾水溶解定容至50 mL作為樣品液待用。吸取2 mL樣品液至20 mL試管中，加入1 mL5%苯酚溶液，混勻，快速加入7 mL濃硫酸，混勻，置于40℃水浴中30 min，再置于冰水浴中5 min，之后快速升至室溫，用分光光度計測定490 nm波長吸光度。以蒸餾水代替待測樣品溶液，用同樣方法操作作為空白對照。

標準曲線繪制：稱取分子量為4萬的葡聚糖0.0500 g，定容至50 mL備用。分別取配好的葡聚糖標準品溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置于100mL容量瓶中，定容，配成質(zhì)量濃度為 10 mg·L-1、 20 mg·L-1、 30 mg·L-1、 40 mg·L-1、 50 mg·L-1葡聚糖標準品溶液，按 “多糖測定方法”進行操作。以蒸餾水為空白，在490 nm波長處分別測定各標準品的吸光度。以葡聚糖質(zhì)量濃度ρ為縱坐標、吸光度A為橫坐標繪制標準曲線，并求出回歸方程。本文計算樣品多糖含量使用分子量4萬葡聚糖得到的回歸方程為ρ=84.458A-1.2272，R2=0.9998，吸光度在0.2～0.8之間，具有良好的線性關系。

1.4.3 蟲草酸測定方法[19]

樣品中蟲草酸總含量測定：稱取樣品0.2500 g，加蒸餾水30 mL，熱回流2 h后，趁熱抽濾，用蒸餾水洗殘渣，將濾液、洗液合并定容至50 mL。量取定容好的溶液1 mL，加入20 mL試管中，加1 mL高碘酸鉀 （0.350 g高碘酸鉀用0.12 mol·L-1鹽酸定容至100 mL）溶液，混勻，室溫放置10 min，加2 mL0.1%L-鼠李糖溶液以除去過多的高碘酸鹽，混勻，加入4 mL新鮮配制的NaSh（7.500 g醋酸銨+100 μL冰醋酸+100 μL乙酰丙酮，定容至 50 mL）試劑，53℃水浴加熱15 min，之后快速冷卻至室溫，用分光光度計測定412nm波長處吸光度。以蒸餾水代替待測樣品溶液，用同樣方法操作作為空白對照。

標準曲線繪制：稱取甘露醇標準品0.0500 g，定容至50 mL備用。分別取配好的標準品溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置于100 mL容量瓶中，定容，配成質(zhì)量濃度為 10 mg·L-1、 20 mg·L-1、 30 mg·L-1、 40 mg·L-1、50 mg·L-1的甘露醇標準品溶液，按 “蟲草酸測定方法”進行操作。以蒸餾水為空白，分別測定412 nm波長處各標準品的吸光度。以甘露醇質(zhì)量濃度ρ為縱坐標、吸光度A為橫坐標繪制標準曲線，并求出回歸方程。回歸方程為ρ=97.836A+0.1873，R2=0.9996，吸光度在 0.2～0.8 之間，具有良好的線性關系。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

1.5.1 描述性分析

對各居群菌株多糖、蟲草酸的測定數(shù)據(jù)用SAS 8.1軟件分別進行最大值、最小值、平均值、標準差、變異系數(shù)分析。

1.5.2 單因素方差分析

對測定數(shù)據(jù)用SAS 8.1軟件進行單因素方差分析，F(xiàn)檢驗(α=0.05)差異顯著者，采用Duncan's多重極差檢驗[20]，分析比較不同居群間的差異，以及各居群內(nèi)多糖、蟲草酸含量最高的菌株間的差異，結(jié)果用±S表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 居群間多糖、蟲草酸含量描述性分析結(jié)果

從表2、表3可以看出：居群間多糖含量平均值從大到小依次為嵩明居群 （SM）＞西山居群 （XS）＞金殿居群（JD）＞野鴨湖居群 （YY）＞白馬雪山冬蟲夏草居群 （BM）＞紫溪山居群 （ZX）＞香格里拉居群 （ZD）＞玉溪居群（YX） ＞沈陽居群 （SY） ＞嵩明野生蛹蟲草居群 （SMY）；居群間蟲草酸含量平均值從大到小依次為白馬雪山冬蟲夏草居群 （BM）＞嵩明野生蛹蟲草居群 （SMY）＞嵩明居群（SM） ＞西山居群 （XS） ＞野鴨湖居群 （YY） ＞居群沈陽（SY） ＞紫溪山居群 （ZX） ＞玉溪居群 （YX） ＞香格里拉居群 （ZD）＞金殿居群 （JD）。多糖含量與蟲草酸含量大小順序并不一致，顯示多糖含量與蟲草酸含量無較好的相關性。就菌絲體而言，云南地區(qū)菌絲體多糖平均含量明顯高于東北地區(qū)菌絲體多糖平均含量，而蟲草酸含量略高于東北地區(qū)菌絲體蟲草酸含量。其中嵩明居群 （SM）與西山（XS）居群菌絲體多糖和蟲草酸含量最高，可以為生產(chǎn)提供較為優(yōu)質(zhì)的菌株來源。

表2 各居群多糖含量描述性分析

表3 各居群蟲草酸含量描述性分析

表4 居群間菌株多糖、蟲草酸含量比較結(jié)果*

2.2 居群間菌株多糖、蟲草酸含量方差分析結(jié)果

從表4可以看出：居群間多糖含量差異顯著 （F=8.064，P<0.05），其中：來自嵩明居群 （SM）菌絲體的多糖含量最高，達 (70.65±39.37)mg·g-1，嵩明野生蛹蟲草居群 （SMY） 最低， 僅為8.58±3.20 mg·g-1。 居群間蟲草酸含量差異顯著 （F=10.439，P<0.05），其中，白馬雪山冬蟲夏草居群 （BM）的蟲草酸含量最高，達 (93.44±93.44)mg·g-1，金殿居群 （JD） 菌絲體的蟲草酸含量最低，為(38.064±15.04)mg·g-1。

表5 各居群菌絲體多糖含量最高菌株多糖含量比較結(jié)果*

2.3 各居群多糖含量最高菌株比較結(jié)果

從表5可以看出：各居群中多糖含量最高的菌株多糖含量差異極顯著 （F=195.459，P<0.01）。 嵩明居群 （SM）的cmilSM5號菌株多糖含量最高，達到 (172.15±5.07)mg·g-1。沈陽居群 （SY）的 cmilSY16號菌株最低，僅為(15.40±4.55)mg·g-1。二者多糖含量相差超過10倍之多。

2.4 各居群蟲草酸含量最高菌株比較結(jié)果

表6 各居群菌絲體蟲草酸含量最高菌株含量比較結(jié)果*

從表6可以看出：各居群中蟲草酸含量最高的菌株蟲草酸含量差異極顯著 （F=457.046，P<0.01）。嵩明居群（SM）的cmilSM5號菌株含量最高，達到 （115.96±3.31）mg·g-1；玉溪居群 （YX）的cmilYY1號菌株最低，僅為（54.36±1.52） mg·g-1，2 者相差超過 2 倍。

圖1 各居群菌絲體的AVE聚類法譜系聚類圖

2.5 各居群Q-聚類分析

從圖1可以看出：沈陽居群 （SY）與玉溪居群 （YX）首先聚為一支后，依次和紫溪山居群 （ZX）、香格里拉居群 （ZD）、 金殿居群 （JD） 聚為一支； 野鴨湖居群 （YY）與西山居群 （XS）聚為一支；嵩明居群 （SM）單獨聚為了一支。聚類結(jié)果與Duncan's多重極差檢驗結(jié)果基本一致，不同居群間化學成分存在較為明顯的差異性。

3 討論

蟲草多糖和蟲草酸為蟲草真菌的次生代謝產(chǎn)物，其含量與菌株自身的遺傳特性及其生長的生態(tài)環(huán)境有很大關系。研究表明，不同居群間多糖和蟲草酸含量差異顯著；多糖與蟲草酸含量無明顯相關性；野生蛹蟲草與冬蟲夏草蟲草酸含量大致相當，野生蛹蟲草多糖含量略低于冬蟲夏草多糖含量，與張顯科研究的結(jié)果一致[16]。

研究發(fā)現(xiàn)，不同生態(tài)地理來源的居群間，其菌株多糖和蟲草酸含量差異顯著。沈陽居群 （SY）、玉溪居群（YX）和香格里拉居群 （ZD）菌株，與其他居群菌株相比，其多糖和蟲草酸平均含量均較低，三者間多糖和蟲草酸含量無統(tǒng)計學差異；嵩明居群 （SM）和西山居群（XS），其多糖和蟲草酸平均含量較高，多糖含量顯著高于沈陽居群 （SY）、 玉溪居群 （YX）、 香格里拉居群 （ZD），蟲草酸含量略高于上述三個菌株來源于我國東北地區(qū)的居群。由此可見，來源于我國東北地區(qū)的蛹蟲草菌株，其多糖和蟲草酸平均含量明顯低于來自滇中地區(qū)蛹蟲草菌株。滇中地區(qū)的蛹蟲草菌株間，其多糖和蟲草酸含量差異也極為顯著，尤以嵩明居群 （SM）的cmilSM5號菌株、西山居群 （XS）的cmilXS10號菌株和野鴨湖居群 （YY）的cmi lYY9以及cmilYY14號菌株最為突出，多糖和蟲草酸含量比較高，顯著高于其他菌株，可作為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)蟲草多糖和蟲草酸的優(yōu)質(zhì)菌株來源。

本次試驗，用嵩明野生蛹蟲草 （SMY）和白馬雪山冬蟲夏草 （BM）作為對照，比較發(fā)現(xiàn)，野生蛹蟲草和冬蟲夏草蟲草酸含量高于所培養(yǎng)的蛹草擬青霉菌絲體，但其多糖含量卻低于所培養(yǎng)蛹草擬青霉菌絲體，其中嵩明野生蛹蟲草 （SMY）蟲草酸含量最高，多糖含量卻最低。

研究材料主要來自于滇中地區(qū)野生蛹蟲草分離菌株所培養(yǎng)的菌絲體，分析表明，嵩明居群 （SM）和西山居群（XS）菌絲體多糖和蟲草酸平均含量較高，可以作為蛹蟲草人工培養(yǎng)供選育的菌種來源。有意義的是，不同地理環(huán)境下生長的蛹蟲草及其菌絲體，其不同活性成分含量存在較大差異，可以為規(guī)?；x育和培養(yǎng)不同活性成的蛹蟲草及其菌絲體提供豐富的遺傳種源；也將為深入開發(fā)高含量的不同活性成分的蛹蟲草及其菌絲體產(chǎn)品奠定基礎。

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