湯倩倩，李 明*，李守勉，田景花，周曉東，陳苗苗

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071001）

同工酶技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食用菌遺傳育種和分類鑒定，酯酶同工酶是同工酶研究中最穩(wěn)定、易檢測的酶系統(tǒng)之一[7]，酯酶同工酶技術(shù)已應(yīng)用到杏鮑菇菌株之間遺傳分析、親緣關(guān)系分析以及雜交菌株的鑒定上[8-10]。通過對杏t菌株的單核菌絲誘變雜交獲得新的子代菌株，并將親本杏t與子代菌絲進(jìn)行酯酶同工酶電泳分析，篩選出具有較強(qiáng)雜種優(yōu)勢的子代新菌株，為菌絲體和子實(shí)體階段的進(jìn)一步篩選提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

杏t，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌研究室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：土豆 （去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL，pH自然母種培養(yǎng)基：棉籽殼200 g、土豆 （去皮）100 g、麩皮 20 g、葡萄糖20 g、蛋白陳5 g、瓊脂20 g，水1 000 mL， pH自然

1.2 方法

1.2.1 單孢稀釋分離及誘變處理

采摘八成熟的杏t子實(shí)體收集孢子，用連續(xù)稀釋法分離孢子，孢子懸浮液濃度約為106個·mL-1，用玻棒均勻涂于PDA平板培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)。待孢子剛剛萌發(fā)，置于30W紫外燈正下方30 cm處進(jìn)行誘變處理，照射時間分別為10 s、 30 s、 1 min、 1.5 min、 2 min、 3 min，再于25℃黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)3 d~5 d。

1.2.2 配對雜交

經(jīng)誘變的單孢子暗培養(yǎng)后，選擇發(fā)育良好的單核菌絲，兩兩配對接種于PDA平板培養(yǎng)基上，相距1.0 cm~1.5 cm，25℃培養(yǎng)9d左右，待菌絲接觸后，挑取交界處部分菌絲鏡檢，若有鎖狀聯(lián)合則轉(zhuǎn)接于斜面母鐘培養(yǎng)基上培養(yǎng)，淘汰菌落形態(tài)不均一，生長較弱的菌株。

1.2.3 拮抗試驗(yàn)

在母種平板培養(yǎng)基上接種親本和雜交子代菌絲體，兩者相距4 cm，25℃恒溫培養(yǎng)，觀察是否有明顯拮抗線產(chǎn)生。

1.2.4 親本及誘變雜交子代的酯酶同工酶分析

酶液提取方法按參考文獻(xiàn)9（王俊玲等）的方法進(jìn)行。

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠濃度為7.5%,濃縮膠濃度為3.75%,電極緩沖液為Tris-Gly系統(tǒng),濃縮膠電壓120 V，分離膠電壓180 V，在4℃條件下電泳。膠條取出后用α,β-醋酸萘酯-堅牢蘭RR鹽法染色，并用7%醋酸固定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單核菌絲的誘變雜交

如圖1所示，長勢較好的杏t單核菌絲 (箭頭所指)純白濃密，氣生菌絲發(fā)達(dá)，爬壁旺盛，但相對雙核菌絲生長速度很慢。

圖1 單核、雙核菌絲對比

經(jīng)鏡檢，獲得16個無鎖狀聯(lián)合的單核菌株 （如圖2），兩兩配對后能連成一片，表示雜交親和，挑取交界處菌絲鏡檢，將有鎖狀聯(lián)合的雙核菌絲 （如圖3）轉(zhuǎn)接于母種斜面培養(yǎng)基上，選取了47株生長速度快、邊緣整齊、純白濃密的優(yōu)良子代。

2.2 拮抗線檢測

圖2 單核菌絲鏡檢圖

圖3 雙核菌絲鏡檢圖

將雜交組合分別與其親本進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，其中有17個雜交菌株與親本能融合生長，無拮抗線產(chǎn)生，說明是同種菌絲；30個雜交菌株與其親本有明顯拮抗線 （如圖4），說明不是同種菌絲，為雜交新組合，隨機(jī)編號為Z1、Z2、Z3、 Z4…Z30。

2.3 雜交子代與親本酯酶同工酶電泳分析

圖4 拮抗反應(yīng)

雜交子代酶譜如果與親本相似，則同源性強(qiáng)，若雜交子代酶譜中出現(xiàn) “雜種新酶帶”或 “互補(bǔ)酶帶”，雜種新酶帶一般1條～2條，則雜交子代雜種優(yōu)勢強(qiáng)；若雜交子代譜帶減少，一般減少2條～3條，且無雜種新酶帶出現(xiàn)，則雜交子代雜種優(yōu)勢較弱。

酯酶同工酶電泳圖譜及模式圖如圖5、圖6所示，親本 （箭頭所指）及30個雜交子代菌株中，共檢測到10條遷移率不同的酶帶，Rf值在0.081~0.707之間，其中共同酶帶一條，Rf值為0.535，可認(rèn)為是杏鮑菇的特征酶帶。根據(jù)親本與子代酯酶同工酶譜帶相對遷移率推測 （見表1），菌株 Z6、 Z13、 Z16、 Z18、 Z22、 Z25、 Z26都有新酶帶出現(xiàn)，可以認(rèn)為這7個誘變雜交子代的雜種優(yōu)勢較強(qiáng)。其中子代Z26和親本杏t相比，除共有的9條酶帶外，在Rf 0.167處多了一條新酶帶。

圖5 雜交子代與親本酯酶同工酶電泳圖譜

圖6 雜交子代與親本酯酶同工酶電泳模式圖

3 討論

本研究采用生理狀態(tài)一致、充分分散的單核菌落進(jìn)行誘變處理，使細(xì)胞能均勻地接觸誘變劑，同時減少了分離性表性延遲現(xiàn)象的發(fā)生。將單核菌落用不同誘變時間處理，從中挑選出生長速度快、長勢旺盛的單核體菌株進(jìn)行配對雜交，以期選育出優(yōu)良的雜交異核體。

同工酶技術(shù)成為菌株分類鑒定重要手段的同時，也廣泛應(yīng)用于食用菌遺傳變異、親緣關(guān)系分析及育種中的菌株特性預(yù)測等研究[11]。將杏鮑菇菌絲體進(jìn)行酯酶同工酶酶譜分析，在相同的測定條件下重復(fù)性好。菌株在子實(shí)體尚未形成之前進(jìn)行菌絲體的酯酶同工酶分析，為早期鑒別誘變菌株提供了一種快速、可靠、簡便的方法，能夠簡單而快速測出親本與子代菌株分子水平的差異。通過對親本杏t及其誘變雜交子代菌絲體的酯酶同工酶酶譜分析，預(yù)測子代出現(xiàn)強(qiáng)優(yōu)勢菌株有 Z6、Z13、Z16、Z18、Z22、Z25、Z26，但對其生物性狀穩(wěn)定性、子實(shí)體經(jīng)濟(jì)性狀、生物轉(zhuǎn)化率等還需進(jìn)一步研究。

表1 雜交親本及其子代酯酶同工酶譜帶相對遷移率

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