荊 蓉，郭成金

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

銀絲草菇 （Volvariella bombycina），隸屬于真菌界、擔(dān)子菌門、層菌綱、傘菌目、光柄菇科、小苞腳菇屬，是一種中溫型木腐菌。自然條件下生于柞木、懸鈴木等的腐木上，另?yè)?jù)報(bào)道在棉籽殼栽培料上也有發(fā)生。在湖北、云南以及北方一些地區(qū)均有分布[1,2]。

銀絲草菇質(zhì)地細(xì)嫩、味道鮮美，具有獨(dú)特的蘭花清香，同近緣種草菇相比，其色澤美觀，不易開傘，較耐低溫，出菇溫度寬，抗逆性強(qiáng)，設(shè)施條件下，南、北方均適合栽培[3,4]。銀絲草菇具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。其蛋白質(zhì)、氨基酸含量高，且包含人體必須的8種氨基酸齊全，礦物質(zhì)含量豐富，特別是磷可達(dá)1.40%[5]。銀絲草菇還具有補(bǔ)脾益氣、清熱解暑、抗壞血癥、提高免疫力、加速創(chuàng)傷愈合、降低膽固醇和抗癌、解毒等功效，是一種較好的營(yíng)養(yǎng)保健食品，具有較高的開發(fā)前景。目前，有關(guān)銀絲草菇的資料報(bào)道較少。作者研究探索了在液體培養(yǎng)條件下,不同碳源、氮源、無機(jī)鹽及維生素對(duì)銀絲草菇菌絲體生長(zhǎng)的影響，為銀絲草菇液體菌種生產(chǎn)與應(yīng)用及細(xì)胞學(xué)育種研究、發(fā)酵生產(chǎn)等提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

銀絲草菇 (Volvariella bombycina)，購(gòu)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種試驗(yàn)中心。

1.2 試驗(yàn)試劑

葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、瓊 脂 、 NH4Cl、 (NH4)2SO4、 MgSO4·7H2O、 KH2PO4、 VB1。以上除注明外均為分析純。馬鈴薯、麥麩、玉米渣、稻草。

1.3 試驗(yàn)儀器

YXQG02手提式壓力蒸汽消毒器 （山東新華醫(yī)療器械廠）；WDP型微生物多用培養(yǎng)箱 （廣東省醫(yī)療器械廠）；電熱恒溫干燥箱 （天津爭(zhēng)光真空儀器廠）。

1.4 供試培養(yǎng)基

1.4.1 綜合培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基+稻草浸提液20%，pH自然。

1.4.2 供試碳源培養(yǎng)基

稻草浸提液2%、酵母粉0.2%、KH2PO40.2%、Mg SO4·7H2O 0.1%、VB10.006%，pH自然。分別以馬鈴薯20%、蔗糖2%、葡萄糖2%、麥芽糖2%、玉米粉2%為供試碳源。

1.4.3 供試氮源培養(yǎng)基

稻草浸提液2%、葡萄糖2%、KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.1%、VB1 0.006%，pH自然。分別以酵母粉0.2%、蛋白胨0.2%、NH4Cl 0.2%、 (NH4)2SO40.2%、牛肉膏0.2%、麥麩0.2%為供試氮源。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 菌種的活化及菌絲體的液體培養(yǎng)

將菌種提前3 d～5 d活化，接種于綜合培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)7 d備用。從生長(zhǎng)旺盛的菌絲體前端，挑取約0.5 cm2大小的菌種塊， 接種于液體培養(yǎng)基 （50·100-1·mL-1三角瓶），每瓶5塊，28℃靜置48 h，然后置于28℃、120 r·min-1旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)168 h，每個(gè)水平3次重復(fù)。

1.5.2 菌絲體干重測(cè)量

將培養(yǎng)168 h的銀絲草菇菌絲體用3層潔凈紗布過濾，蒸餾水沖洗3次，于60℃烘箱中烘干至恒重，再次稱重。

1.5.3 碳源、氮源培養(yǎng)基正交試驗(yàn)

依據(jù)碳、氮源單因素試驗(yàn)結(jié)果,各選2個(gè)較好的碳源、氮源,按L9(34)設(shè)計(jì)4因素、3水平正交試驗(yàn),與KH2PO40.2%、 MgSO4·7H2O 0.1%、 VB10.006%組成 9個(gè)配方,進(jìn)一步篩選出較適培養(yǎng)基。正交因素與水平如表1。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平

1.5.4 無機(jī)鹽及維生素水平試驗(yàn)

依據(jù)正交試驗(yàn)篩選的最佳結(jié)果，再將KH2PO4、Mg SO4·7H2O和VB1設(shè)置不同濃度梯度，具體處理見表2

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)銀絲草菇菌絲體生長(zhǎng)的影響

碳源是構(gòu)成菌絲體細(xì)胞和含碳次生代謝產(chǎn)物的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也是其主要能量來源。培養(yǎng)了7 d的菌絲體，直觀即可見明顯差異，只有蔗糖和葡萄糖作為碳源時(shí)，呈小米粒狀、均勻的菌絲球，其余配方呈不規(guī)則塊狀、片狀，粘連一團(tuán)。從表3、表4可以看出，銀絲草菇對(duì)碳源的利用比較廣泛，從成分復(fù)雜的復(fù)合碳源，到單糖和雙糖等小分子均可利用；且具有選擇性[6]。其中以蔗糖最好，葡萄糖次之，玉米粉最差。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析 (表4)F值為89.678，大于F4,10,0.01=5.994[7]，表明不同碳源培養(yǎng)基對(duì)銀絲草菇菌絲體生物量的影響在0.01水平上差異極顯著。應(yīng)用Duncan's測(cè)驗(yàn)法多重比較結(jié)果表明，除馬鈴薯與玉米粉之間差異不顯著外，其他彼此之間在0.01水平上差異極顯著，綜合上述分析選擇蔗糖與葡萄糖作為正交試驗(yàn)兩碳源。

表3 不同碳源對(duì)銀絲草菇菌絲體生長(zhǎng)的影響

表4 不同碳源配方下銀絲草菇菌絲體生物量的方差分析

2.2 不同氮源對(duì)銀絲草菇菌絲體生長(zhǎng)的影響

氮源主要參與蕈菌菌絲細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸以及含氮化合物等細(xì)胞關(guān)鍵組分的合成[2]。試驗(yàn)結(jié)果 （表5、6）表明，供試氮源以酵母粉和蛋白胨效果最好，而 (NH4)2SO4和NH4Cl效果最差。這也證明了有機(jī)氮源較無機(jī)氮源更有利于銀絲草菇的生長(zhǎng)[8]。推測(cè)可能是食用菌在使用無機(jī)氮源時(shí)，菌絲必須自行合成所需各種氨基酸，而有機(jī)氮源中含有豐富的脂肪酸、維生素、游離氨基酸等[9]，可被菌絲直接利用。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析F值為31.109，大于F5,12,0.01=5.064[7]，表明不同氮源培養(yǎng)基對(duì)銀絲草菇菌絲體生物量的影響在0.01水平上差異極顯著。應(yīng)用Duncan's檢測(cè)法多重比較表明，酵母粉與蛋白胨，麥麩與牛肉膏， (NH4)2SO4與 NH4Cl這三組之間在0.01水平上差異極顯著，其中兩兩之間差異不顯著。綜合上述分析選擇酵母粉與蛋白胨作為正交試驗(yàn)兩氮源。

2.3 碳源、氮源正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 不同氮源對(duì)銀絲草菇菌絲體生物量的影響

表6 不同氮源配方下銀絲草菇菌絲體生物量的方差分析

根據(jù)表7的極差值 (R)分析，各因素對(duì)銀絲草菇菌絲體生物量影響大小依次為蔗糖＞葡萄糖＞酵母粉＞蛋白胨，可見碳源蔗糖是影響菌絲生物量的主要因素。比較水平之間K值大小，得到最佳水平組合為A3B2C3D2，即葡萄糖20 g·L－1、 蔗糖 10 g·L－1、 酵母粉 2.5 g·L－1、 蛋白胨 2 g·L－1。經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，其菌絲體平均生物量為9.89g·L－1，大于任一處理組，與分析結(jié)果一致。經(jīng)計(jì)算其C/N約為21:1，接近菌絲體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段最適碳氮比理論值20:1。

表7 L9（34）正交直觀分析表

2.4 不同無機(jī)鹽和VB1濃度對(duì)銀絲草菇菌絲體生長(zhǎng)的影響

無機(jī)鹽和維生素均可作為酶的組成部分進(jìn)而影響蕈菌的代謝活動(dòng)。對(duì)無機(jī)鹽與維生素的篩選結(jié)果表明不同處理間差異顯著，其中處理3優(yōu)于其它3個(gè)，即KH2PO42.5 g·L－1、 MgSO4·7H2O 1.5 g·L－1、 VB18 mg·L－1。 見表 8、 9。

3 結(jié)論

表8 無機(jī)鹽及VB1對(duì)銀絲草菇菌絲體生物量的影響

表9 不同無機(jī)鹽及VB1下銀絲草菇菌絲體生物量方差分析

試驗(yàn)結(jié)果表明，銀絲草菇最適液體培養(yǎng)基為葡萄糖20 g·L－1、 蔗糖 10 g·L－1、 酵母粉 2.5 g·L－1、 蛋白胨 2 g·L－1、

圖1 銀絲草菇液體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體形態(tài)

KH2PO4 2.5 g·L－1、 MgSO4·7H2O 1.5 g·L－1、 VB18 mg·L－1，pH 自然。 28℃、 120 r·min－1搖瓶培養(yǎng) 168 h，其生物量達(dá)到11.54 g·L－1。銀絲草菇最適液體培養(yǎng)基最適碳氮比約為21:1。

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