袁 起 新，朱 蓓 薇，董 秀 萍，周 大 勇，張 爽，劉 芳

（大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引言

鮑隸屬軟體動物門（Mollusca）腹足綱（Gastropoda），全世界各海區(qū)已命名的鮑魚有216種，常見種類約30 種，在中國沿海分布主要有7種［1］，其可食部分鮑魚腹足中膠原蛋白含量較豐富且含量多少直接影響其嫩度［2］。膠原蛋白類型很多，Soderhall等［3］于2007 年報道了與人表皮特異性皮炎有關(guān)的XXIX 型膠原，至此，膠原蛋白家族已有29種。

目前，國內(nèi)外在膠原蛋白研究方面以魚類為主，無脊椎動物海參［4］、魷魚［5］、海膽［6］的研究也較為深入。有關(guān)鮑魚膠原蛋白研究相對較少，KIMURA 等［7-8］對鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白進行了提取純化，并對其氨基酸組成以及一些物理性質(zhì)進行了研究，通過電泳技術(shù)分析其膠原結(jié)構(gòu)類型為［α］3。Olaechea等［2］報道鮑魚腹足不同部位的膠原蛋白含量不同，且膠原蛋白的含量與其韌性成正比例關(guān)系。

本實驗以皺紋盤鮑為原料，用胃蛋白酶提取其腹足酶促溶性膠原蛋白，通過圓二色譜鑒定所提取膠原的結(jié)構(gòu)完整性，進一步考察其理化性質(zhì)及功能特性，為鮑魚精深加工提供理論依據(jù)，滿足人們對高品質(zhì)鮑魚的消費需求。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

鮮活皺紋盤鮑（Haliotisdiscus），購于市場；氯化鈉、氯化鉀、氫氧化鈉、乙酸等，國產(chǎn)分析純；胃蛋白酶，分析純，Sigma公司。

1.2 儀 器

UV2100型紫外可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；pH 計，上海鵬順科學(xué)儀器有限公司；T25數(shù)顯勻漿機，德國IKA；Z-323K 冷凍離心機，德國Hermle；J810 圓二色譜儀，日本分光公司。

1.3 方 法

1.3.1 基本組成成分分析

水分測定采用常壓干燥法（GB 5009.3—2010）；粗蛋白測定采用凱氏定氮法（GB 5009.5—2010）；總糖測定（GB/T 15038—2006）；粗脂肪測定采用索氏抽提法（GB/T 14772—2008）；灰分測定采用高溫灼燒法（GB 5009.4—2010）。

1.3.2 鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白的提取

參考文獻［9］的方法并略加改進，新鮮鮑魚去內(nèi)臟，清洗并去除與殼肌連接的中間部分，勻漿后用10倍的冷去離子水洗，離心后棄上清。鮑魚勻漿組織加入10倍體積的0.6mol/L KCl溶液攪拌24h，5 000g離心15min，重復(fù)洗3次；所得沉淀加10倍體積0.45mol/L NaCl溶液攪拌24h，5 000g離心15min，重復(fù)洗3次；所得沉淀加10倍體積0.1mol/L NaOH 溶液攪拌過夜，去離子水洗至中性，沉淀即為粗膠原纖維。再加10倍體積0.5mol/L乙酸攪拌48h，除去酸溶性膠原蛋白，10 000g離心30min；所得沉淀在0.5mol/L乙酸中用胃蛋白酶酶解72h，酶與底物質(zhì)量比為3∶20；12 000g離心，上清液加入4 mol/L NaCl使其終濃度為0.8mol/L，冷凍離心，棄上清。沉淀復(fù)溶于0.5 mol/L 乙酸，所得溶液先用0.02mol/L Na2HPO4透析，再用0.1 mol/L 乙酸透析，凍干即得鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白。以上所有操作除特殊注明外，均在4 ℃下進行。

1.3.3 鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白提取率的計算

式中，m1為凍干膠原質(zhì)量，g；m2為未經(jīng)前處理的鮑魚腹足原料干重，g。

1.3.4 鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白的圓二色譜鑒定

準(zhǔn)確稱量一定量的凍干鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白，用0.02 mol/L 乙酸配成質(zhì)量濃度為0.2mg/mL的蛋白溶液。將其注入1mm 光徑的石英池，采用JASCO J-810圓二色譜儀對樣品在190～260nm 進行掃描，掃描速率為100nm/min，次數(shù)為3次。

1.3.5 鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白的等電點測定

取0.01g 鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白凍干品溶解在3mL 0.5mol/L 乙酸中；待澄清后，用1mol/L NaOH 溶液滴定直到出現(xiàn)渾濁沉淀，且沉淀不再溶解。用pH 計測定懸濁液的pH，平行測3組，取平均值即為該樣品的等電點。

1.3.6 鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白的起泡性和起泡穩(wěn)定性

取0.03g鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白溶解到100mL 0.5 mol/L乙酸溶液中（pH 3.0～3.5），然后用勻漿機以12 000r/min速度均質(zhì)2min，記錄均質(zhì)停止時泡沫體積，起泡性計算如下：

式中，V為均質(zhì)停止時起泡體積，mL。

記錄均質(zhì)停止1、10、30、60、120 min后泡沫的體積，以此來衡量泡沫穩(wěn)定性。

1.3.7 鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性

稱取0.03g鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白樣品，將其溶解到50mL的0.5mol/L 的乙酸溶液中，加入50 mL 精煉油，該樣液的pH 為3.0～3.5，用勻漿機以12 000r/min的速度均質(zhì)2min，取20mL均勻樣液，裝在20mL的刻度試管中置于恒溫水浴鍋中，50 ℃水浴，在5h內(nèi)每隔1h測一次乳狀液的體積。乳化性及乳化穩(wěn)定性計算如下：

式中，H0為乳化層高度，cm；H為總高度，cm；V為最終乳狀液的體積，mL；V0為最初乳狀液的體積，mL。

1.3.8 鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白的Fe2+螯合活性

參照Hsu等［10］方法，1mL 不同濃度鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白溶液，與50μL 氯化亞鐵（2mmol/L）和1mL 去離子水混合均勻后室溫靜置5min，再加入100μL 菲咯嗪（5mmol/L），均勻后室溫靜置5min，反應(yīng)結(jié)束后，在2 000g條件下離心10 min，取上清液測其在562nm 下吸收值。亞鐵離子螯合能力計算如下：

式中，As為樣品測定值；A為用等體積去離子水取代樣品后的測定值。

2 結(jié)果與討論

2.1 鮑魚腹足主要組成成分

經(jīng)測定鮑魚腹足原料含水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71.38%，粗蛋白為15.14%，總糖、粗脂肪、灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表1。鮑魚腹足各個部分膠原蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大［2］，而且季節(jié)不同膠原質(zhì)量分?jǐn)?shù)也不同［11］。本實驗以4月份鮑魚為原料，根據(jù)方法“1.3.1”對其組分進行測定，結(jié)果如表1所示。

表1 鮑魚腹足基本組成成分Tab.1 The main chemical composition of the foot of Haliotis discus

2.2 鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白提取率

如圖1所示，將鮑魚腹足分為與閉殼肌相連的中間部分A 及過渡和邊緣部分B，通過羥脯氨酸法對各部位膠原質(zhì)量分?jǐn)?shù)進行測定。結(jié)果顯示，鮑魚腹足B 部膠原質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，占干基的34.37%；而A 部分膠原的質(zhì)量分?jǐn)?shù)略低，僅為20%左右。Olaechea等［2］也報道了鮑魚腹足不同部分膠原蛋白含量有所不同，只是部位的劃分與本文有所不同。因此，本實驗選取鮑魚腹足邊緣部分B，對其膠原蛋白進行提取及相關(guān)性質(zhì)研究。

鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白提取率為8.72%（以干基計），低于草魚皮（46.6%）［12］、魷魚（16.4%）［13］，本實驗中采用胃蛋白酶促溶提取的膠原蛋白得率略低，主要是因為鮑魚腹足膠原蛋白含量較魚皮等低，且其PSC 分子間交聯(lián)程度大。

圖1 鮑魚腹足取樣部位圖Fig.1 Illustration of sampling locations

2.3 鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白的圓二色譜鑒定

鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白在遠(yuǎn)紫外區(qū)（190～260nm）的圓二色譜見圖2。由圖2可知，在221nm 處有一個正峰，在199nm 處存在一負(fù)槽，具有典型膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)的特征圓二色譜峰型［14］，與其他來源膠原蛋白圓二色譜峰型相類似［15-16］。手性物質(zhì)對右圓偏振光和左圓偏振光的吸收（振幅減?。┎煌?，使左、右圓偏振光疊合成橢圓偏振光，稱為圓二色性［17］。在蛋白質(zhì)或多肽中主要的光活性基團是肽鏈骨架中的肽鍵、芳香氨基酸殘基及二硫鍵。遠(yuǎn)紫外區(qū)圓二光譜在肽鍵吸收峰范圍內(nèi)，反映了主鏈構(gòu)象。膠原蛋白由3條左手螺旋α肽鏈相互纏繞成右手螺旋結(jié)構(gòu)，當(dāng)螺旋結(jié)構(gòu)破壞時，221nm 附近的正峰會隨之消失。

圖2 鮑魚腹足酶促溶膠原蛋白圓二色譜圖Fig.2 CD spectra of PSC solution from the foot of Haliotis discus

2.4 鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白等電點的測定

用乙酸溶解的鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白等電點為pH 5.17。蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)，在不同pH 下有不同的溶解度。在等電點時，蛋白質(zhì)分子的酸性解離與堿性解離相等，即所帶正負(fù)電荷相等，凈電荷為零，因此其物理化學(xué)性質(zhì)都發(fā)生較大變化，如溶解度、黏度、電導(dǎo)率等都達(dá)到最低值。

2.5 鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白的起泡性和起泡穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)的起泡性是指蛋白質(zhì)在水中攪打起泡的能力，泡沫穩(wěn)定性是指泡沫保持穩(wěn)定的能力。起泡性和泡沫穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)的濃度存在著一定關(guān)系，溫度也對其有影響。在形成泡沫前，適當(dāng)?shù)臒崽幚砟芨倪M蛋白質(zhì)產(chǎn)品的起泡性，但是泡沫穩(wěn)定性降低。蛋白質(zhì)分子組成中疏水氨基酸含量越多，乳化能力就越強，越容易吸附在液滴表面形成泡沫。鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白起泡性與起泡穩(wěn)定性結(jié)果見表2。由表2可知鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白質(zhì)量濃度為0.3mg/mL時，其起泡性高達(dá)110%，略低于羅非魚皮起泡性（128%）［17］，泡沫穩(wěn)定性一般。

表2 鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白的起泡性與泡沫穩(wěn)定性Tab.2 Foam-producing and foam stability of PSC from the foot of Haliotis discus

2.6 鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性

一般的乳化系統(tǒng)是由乳化劑（表面活性劑）將互不相溶的水相與油相經(jīng)高速攪拌乳化而成的。蛋白質(zhì)也是一種表面活性劑，具有乳化作用，因此蛋白質(zhì)能使油水結(jié)合在一起并形成乳狀液。膠原蛋白脯氨酸和羥脯氨酸等疏水性氨基酸含量較高，所以其乳化性較強。乳化穩(wěn)定性是指油水乳狀液保持穩(wěn)定的能力，膠原蛋白所含的疏水性氨基酸以亞氨基酸為主，芳香族氨基酸含量較少，可能致使其乳化穩(wěn)定性較差。鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白在pH 3.0～3.5、室溫條件下乳化性和乳化穩(wěn)定性見表3。由表3 可知，質(zhì)量濃度為0.3mg/mL鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白有良好的乳化性，乳化能力達(dá)到100%；但乳化穩(wěn)定性一般，放置5h后，僅保持在50%左右。

表3 鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性Tab.3 Emulsifiability and emulsion stability of PSC from the foot of Haliotis discus

2.7 鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白Fe2+螯合能力

膠原是一種天然高分子配體，其分子結(jié)構(gòu)中的氨基、羧基、羥基、胍基等側(cè)基在不同條件下可與一些金屬離子發(fā)生配位反應(yīng)，生成金屬膠原配位化合物。游離的二價鐵離子對氧非常敏感，可以與其反應(yīng)生成三價鐵離子和過氧化氫。游離二價鐵離子還會與過氧化氫反應(yīng)生成羥自由基，而羥自由基是對機體傷害最大的活性氧基團之一。因此，F(xiàn)e2+螯合能力可反映物質(zhì)的抗氧化能力。

鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白Fe2+螯合能力結(jié)果見圖3。由圖3可見，鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白具有較強的Fe2+螯合能力，在0.2～1.2mg/mL內(nèi)，螯合能力隨質(zhì)量濃度的上升而增加，其IC50值（螯合率為50%時樣品的質(zhì)量濃度）為0.348mg/mL，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL 時螯合能力可達(dá)91.62%?？梢?，鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白可有效抑制不飽和脂肪酸氧化以及自由基氧化反應(yīng)的發(fā)生。

圖3 不同濃度鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白對Fe2+螯合能力的影響Fig.3 Effect of different PSC concentrations on iron（Fe2+）-chelating activity

3 結(jié)論

（1）用胃蛋白酶提取的鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白提取率為8.72%（以干基計），三螺旋結(jié)構(gòu)完整。

（2）鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白的等電點為pH 5.17，具有較好起泡性和乳化性，但穩(wěn)定性均相對較差。

（3）鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白具有較強Fe2+螯合能力，其IC50值為0.348mg/mL。