徐 揚(yáng)，楊 霄，安 家 彥

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引言

甘油是酒精發(fā)酵生產(chǎn)中主要副產(chǎn)物之一。近年來許多學(xué)者在酵母細(xì)胞的甘油代謝及生理功能方面開展了深入的研究。甘油為非揮發(fā)性物質(zhì)，它的黏性和甜味可使酒具有圓潤、柔滑、更易入口的特性，也可用于平衡酒中的酸感，增加口感復(fù)雜性，是高品質(zhì)酒的重要成分［1］。在酒精發(fā)酵過程中多產(chǎn)甘油有利于提高葡萄酒的質(zhì)量［2］。

本研究旨在對啤酒、葡萄酒生產(chǎn)用酵母發(fā)酵酒精的條件下生成甘油的動(dòng)力學(xué)關(guān)系進(jìn)行研究，了解其甘油在酵母發(fā)酵過程中的變化趨勢，可以估計(jì)發(fā)酵生產(chǎn)中甘油的含量，以提高酒的質(zhì)量。同時(shí)對酒精生產(chǎn)酵母的甘油生成關(guān)系進(jìn)行比較，以期獲取甘油生成的共性關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌 種

啤酒酵母、葡萄酒1＃酵母、酒精酵母，均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，玉米漿5.0g/L，自來水配制，pH 自然，121 ℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿2.0g/L，葡萄糖120g/L，pH 自然，121 ℃滅菌20min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

從菌種斜面刮取菌落一環(huán)，接種于種子培養(yǎng)基中，30 ℃、20r/min培養(yǎng)48h，按10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中30℃靜置培養(yǎng)，并間隔一定時(shí)間取樣測定。

1.2.2 生物量的測定

取0～0.500g 的梯度稱取酵母泥定容至1 000L，在560nm 處測吸光度。同時(shí)取相同量的酵母泥于事先稱量好的平皿中放置于烘箱中80 ℃烘干，時(shí)間為5h，測量出酵母泥的干重。以酵母干重為縱坐標(biāo)、吸光度為橫坐標(biāo)繪制酵母干重的標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)酵液離心后，將酵母泥定容到100mL容量瓶中，在560nm 處測出吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出酵母干重。

1.2.3 還原糖的測定

采用3，5-二硝基水楊酸光度法［3］測定還原糖。

1.2.4 甘油的測定

本次研究所涉及到的數(shù)據(jù)都通過SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料表示為±s，進(jìn)行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料表示為百分率（%），予以χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

（1）采用高碘酸氧化法［4］。

（2）由于發(fā)酵液中的殘?zhí)桥c高碘酸反應(yīng)，為除去干擾，根據(jù)“（1）”的方法繪制葡萄糖干擾曲線，從而用已知?dú)執(zhí)堑臐舛葋慝@得殘?zhí)撬腘aOH 溶液的體積（V2）。

（3）甘油質(zhì)量濃度按式（1）計(jì)算。

式中，n為取液量（mL），n=2；c為NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mol/L）；V1為發(fā)酵液消耗的總的NaOH溶液的體積；V2為發(fā)酵液中殘?zhí)窍牡腘aOH溶液的體積。

1.2.5 葡萄糖干擾曲線的測定

分別配制0、15、30、45、60、75g/L 的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。以蒸餾水作為空白樣，取樣品2 mL于三角瓶中，加水10 mL，加入酚酞指示劑，用0.1mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至變色。然后加入10 mL 0.1 mol/L 高碘酸鈉溶液，避光反應(yīng)5min，再加入25%乙二醇溶液5 mL，避光反應(yīng)5min。然后用上述NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至變色，變色程度應(yīng)與前次變色程度相當(dāng)，記錄所用NaOH 溶液的體積。

根據(jù)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液所消耗的NaOH溶液的體積（V2）為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制葡萄糖干擾曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

啤酒酵母、酒精酵母、葡萄酒1＃酵母在12%的葡萄糖培養(yǎng)基下發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1～3。由圖1～3 可知，本研究使用的幾株酒精發(fā)酵酵母，生成甘油過程屬于生長部分偶聯(lián)型。

2.2 動(dòng)力學(xué)模型的建立

2.2.1 菌體生長模型

Verhulstl提出在某一特定環(huán)境條件下，應(yīng)有一最大的細(xì)胞質(zhì)量濃度，它相當(dāng)于生物學(xué)中的負(fù)載能力［5］，利用上述概念提出了Logistic方程，在該方程中將比速率與尚未利用的負(fù)載能力相關(guān)聯(lián)，即在生長期細(xì)胞的增長速率可以用下式表達(dá)

圖1 啤酒酵母發(fā)酵過程曲線Fig.1 Beer yeast fermentation process curve

圖2 葡萄酒1＃酵母發(fā)酵過程曲線Fig.2 Wine yeast fermentation process curve

圖3 酒精酵母發(fā)酵過程曲線Fig.3 Alcohol yeast fermentation process curve

式中，μm 為細(xì)胞生長最大比速率，h-1；Xm為細(xì)胞質(zhì)量濃度最大值（干質(zhì)量），g/L；X為酵母質(zhì)量濃度（干重），g/L；t為時(shí)間，h。

將式（1）積分得

用Origin Pro 8.1軟件對菌株生長方程進(jìn)行擬合，其酵母生長動(dòng)力方程擬合參數(shù)如表1所示。

2.2.2 乙醇發(fā)酵中甘油生成動(dòng)力學(xué)

以Luedeking-Piret關(guān)系式［6］來描述產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長的關(guān)系。

表1 酵母生長動(dòng)力學(xué)方程擬合參數(shù)Tab.1 Yeast growth dynamics equations of fitting parameters

由圖1～3可以看出，甘油合成與細(xì)胞生長屬于部分偶聯(lián)型，因此選用Luedeking-Piret方程公式（4）對甘油的生成進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析［7］。

將式（4）積分得

式中，ρ為t時(shí)的甘油質(zhì)量濃度；ρ0 為0時(shí)刻的甘油質(zhì)量濃度；α為與生長相關(guān)聯(lián)的甘油形成系數(shù)，g/g；β為非生長相關(guān)聯(lián)的甘油形成系數(shù)，h-1。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用軟件Origin Pro 8.1對式（5）進(jìn)行非線性擬合，擬合后見表2。

表2 甘油生成的動(dòng)力學(xué)方程擬合α、β值Tab.2 Glycerin generate the dynamic equations of fittedα，βvalues

由表2可知β遠(yuǎn)比α小，可以忽略不計(jì)。于是甘油生成與細(xì)胞生長可以近似于生長偶聯(lián)型，可以用Logistic方程直接進(jìn)行擬合。

式中，ρ0 為0時(shí)刻的甘油質(zhì)量濃度；ρ為甘油生成質(zhì)量濃度，g/L；ρm 為甘油質(zhì)量濃度最大值，g/L；μpm為甘油生產(chǎn)最大比速率，h-1。

式中，ρ0、ρm、μpm等為需擬合參數(shù)。其擬合曲線與實(shí)測值曲線見圖4。

3 結(jié)論

圖4 種酵母產(chǎn)甘油的實(shí)驗(yàn)值與擬合值比較Fig.4 Three kinds of yeast production of the experimental value of glycerol and fitting value comparison

研究表明用Logistic方程可很好地描述啤酒生產(chǎn)酵母、葡萄酒1＃酵母的生長動(dòng)力學(xué)關(guān)系；其甘油生成關(guān)系用Luedeking-Piret方程回歸，其常數(shù)α遠(yuǎn)大于β，說明甘油生成符合酵母生長的偶聯(lián)型模型，以偶聯(lián)型回歸具有很好的相關(guān)性（R2均大于0.97）；實(shí)踐中的甘油生成與酒體的圓潤有關(guān)，發(fā)酵前期為酵母生長速率的高低會(huì)直接影響甘油生成速率的高低；實(shí)驗(yàn)中比較了酒精生產(chǎn)酵母的甘油生成關(guān)系，其與啤酒生產(chǎn)酵母、葡萄酒1＃酵母的動(dòng)力學(xué)關(guān)系是一致的。