張 歡，叢 麗 娜，侯 英 敏，王 丹，謝 三 群

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引言

枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種抗菌代謝產(chǎn)物［1］，其活菌被認(rèn)為具有改善水生動物消化道和改良水環(huán)境的雙重功效?？莶菅挎邨U菌能簡單地利用“競爭性抑制”即與病原菌競爭生存空間和營養(yǎng)，來實(shí)現(xiàn)對疾病的生物控制，是公認(rèn)的具有水產(chǎn)養(yǎng)殖價(jià)值的益生菌［2］。本實(shí)驗(yàn)室從大連海域海參腸道中篩選得到一株枯草芽孢桿菌HS-A38，初步研究表明，該芽孢桿菌能顯著抑制革蘭氏陽性和陰性菌的生長，具有廣譜的抗菌活性，尤其是對水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌等致病菌有較強(qiáng)的抑制作用。開發(fā)益生菌制劑，首先必須滿足具有足夠的活菌數(shù)量，這樣方能作為優(yōu)勢菌群占據(jù)宿主的腸道，從而達(dá)到治療和預(yù)防疾病的目的［3］。因此，為了將HS-A38芽孢桿菌開發(fā)成水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌制劑，需要提高發(fā)酵菌體的濃度水平，以降低生產(chǎn)成本，提高芽孢得率［4］。本研究以前期實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基組分，即首先應(yīng)用Plackett-Burman析因?qū)嶒?yàn)確定對菌濃生長影響顯著的因子，然后利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)趨近曲面的穩(wěn)定點(diǎn)，最后根據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)（CCD）得到最佳培養(yǎng)基配比。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）HS-A38：本實(shí)驗(yàn)室自行分離，16SrDNA 序列在GenBank的檢索號為GQ 466597。

Zobell 2216E種子培養(yǎng)基：酵母膏1.0g/L，蛋白胨5.0g/L，磷酸鐵250.0g/L，瓊脂15～20g/L，pH 7.2～7.4。

發(fā)酵初始培養(yǎng)基：葡萄糖4.5g/L，豆粕粉13.50g/L，尿素0.6g/L，酵 母膏3.60g/L，K2HPO44.50g/L，ZnSO40.09g/L，pH 7.2～7.4。

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)、爬坡實(shí)驗(yàn)和中心組合實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基：均采用實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的配方［5］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過Design expert 7.13實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件［6］和Origin 7.50軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。

1.2 菌種活化與培養(yǎng)

種子液活化條件：一級活化挑取少量斜面菌種，接入容量為100mL、裝液量為20mL 的種子培養(yǎng)基中，30 ℃、轉(zhuǎn)速160r/min搖床培養(yǎng)12h。二級活化按5%的體積分?jǐn)?shù)接入一級活化種子液、容量為250mL、裝液量為50mL 的發(fā)酵初始培養(yǎng)基，并且按一級活化條件培養(yǎng)20h。

1.3 活菌計(jì)數(shù)

采用平板菌落計(jì)數(shù)法［7］，并針對本實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)作部分改進(jìn)。把發(fā)酵菌液按梯度稀釋成10-5、10-6，分別取40和80μL涂布，放入30℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待長出單菌落后數(shù)出每個(gè)平板上的菌落個(gè)數(shù)并記錄，個(gè)數(shù)在30～300為有效值。以每毫升菌液中活細(xì)胞的個(gè)數(shù)計(jì)算得出的值為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的響應(yīng)值，其中，每毫升菌液中活細(xì)胞的個(gè)數(shù)（cfu/mL）=同一稀釋度3 次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×103/取樣量。

1.4 菌株HS-A38的生長曲線

為確定取樣的最佳時(shí)間，測得菌株HS-A38的生長曲線。配制發(fā)酵初始培養(yǎng)基，裝液量均為20 mL，容量為100 mL的三角瓶，在30 ℃、160r/min搖床培養(yǎng)15h，然后每隔2h 取樣，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)計(jì)算測出活菌濃度。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、活菌數(shù)為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.5 Plackett-Burman設(shè)計(jì)

采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對影響菌株HS-A38 發(fā)酵菌體濃度的最佳組成，即葡萄糖（X1）、豆粕粉（X2）、尿素（X3）、酵母膏（X4）、K2HPO4（X5）、ZnSO4（X6）這6個(gè)因素進(jìn)行全面考察。選用N=16，并且添加4個(gè)空余項(xiàng)用來估計(jì) 誤差的P-B 設(shè)計(jì)［8］，實(shí)驗(yàn)結(jié)果 用Design expert 7.13軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

通過Plackett-Burman 設(shè)計(jì)確定影響菌株HS-A38發(fā)酵濃度的顯著性因素，然后通過各顯著性因素的正負(fù)效應(yīng)（相關(guān)系數(shù)ri）決定下一步最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的爬坡路徑（包括變化方向和變化的步長），以快速逼近曲面的穩(wěn)定點(diǎn)區(qū)域［9］。

1.7 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)確定影響菌株HS-A38發(fā)酵菌體濃度的主要因素，進(jìn)而由最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近影響菌體發(fā)酵濃度響應(yīng)面穩(wěn)定區(qū)域，并確定顯著性因素的穩(wěn)定點(diǎn)水平，探究該穩(wěn)定區(qū)域的性質(zhì)。為做到這一點(diǎn)，必須用一個(gè)至少二階多項(xiàng)式去擬合該區(qū)域中適當(dāng)配置的一組點(diǎn)位。用Design expert 7.13 軟件對模型進(jìn)行回歸擬合得到二階經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?/p>

式中，Y為預(yù)測響應(yīng)值即發(fā)酵活菌濃度，β為回歸系數(shù)，X為因素水平。

1.8 活菌濃度測定

將二級活化的菌液按5%的體積分?jǐn)?shù)接入相應(yīng)的發(fā)酵培養(yǎng)基中（裝液量均為20 mL，容量為100mL的三角瓶），在30 ℃、160r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)到發(fā)酵平穩(wěn)時(shí)期，取樣并且按照“1.3”的方法計(jì)算得各設(shè)計(jì)組的活菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HS-A38的生長曲線

為了得到有效響應(yīng)值，取樣時(shí)間必須控制在發(fā)酵的平穩(wěn)期。根據(jù)菌株HS-A38 的生長曲線（圖1），將后續(xù)實(shí)驗(yàn)取樣時(shí)間點(diǎn)設(shè)為培養(yǎng)23h后，以得到合理的響應(yīng)值。

2.2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選影響菌體濃度的顯著性因子

圖1 HS-A38生長曲線Fig.1 Growth curve of the strain HS-A38

通過一系列單因素實(shí)驗(yàn)，確定葡萄糖、豆粕粉、尿素、酵母膏、K2HPO4和ZnSO4作為培養(yǎng)基的基本組成進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檫@6個(gè)因素對菌株HS-A38的發(fā)酵濃度的影響較大。每個(gè)因素的實(shí)驗(yàn)濃度按照高水平是低水平的1.25倍［10］取高低兩個(gè)水平。Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表1，其中活菌濃度（Y）作為響應(yīng)值（每組實(shí)驗(yàn)做3次平行，取平均值）。

采用Design expert 7.13軟件對表1結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。由表2可知，整個(gè)模型的來源可靠，對菌株HS-A38發(fā)酵菌體濃度有顯著性影響（P＜0.05）的因素有葡萄糖和ZnSO4，其中葡萄糖有顯著的正效應(yīng)，ZnSO4有顯著的負(fù)效應(yīng)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)主要考察這兩個(gè)因素，且適當(dāng)增加葡萄糖，減少ZnSO4。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Tab.1 The results of Plackett-Burman design

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)水平及回歸模型方差分析Tab.2 The levels of Plackett-Burman and analysis of variance for regression model

2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

為了逼近影響發(fā)酵菌體濃度的穩(wěn)定響應(yīng)面區(qū)域，以建立有效的擬合方程，必須確定響應(yīng)面區(qū)域中最大響應(yīng)值處（穩(wěn)定點(diǎn)）各個(gè)顯著性因素水平的情況［11］。最陡爬坡實(shí)驗(yàn)是一種快速尋找穩(wěn)定點(diǎn)的方法，首先根據(jù)Plackett-Burman 法篩選出的顯著因子相關(guān)系數(shù)來設(shè)計(jì)它們的步長［5，11］，當(dāng)設(shè)定葡萄糖步長ΔX1=1.5，計(jì)算得到ZnSO4步長ΔX6=-0.015；然后根據(jù)ΔX1、ΔX6設(shè)計(jì)X1、X6的變化路徑（見表3），并將X2、X3、X4、X5的因素水平（g·L-1）固定（見表1中最大菌體濃度的第12組實(shí)驗(yàn)），配制不同組分的培養(yǎng)基，按照方法“1.8”測定設(shè)計(jì)組的發(fā)酵菌體濃度，實(shí)驗(yàn)響應(yīng)值（Y）結(jié)果如表3所示。其中第（4）組實(shí)驗(yàn)因素對菌體發(fā)酵濃度的影響最大，響應(yīng)變量接近最大響應(yīng)區(qū)域，故選用該組因素水平臨近范圍的水平，即葡萄糖8.0g/L、ZnSO40.065g/L為穩(wěn)定點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2.4 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

以葡萄糖和ZnSO4兩個(gè)顯著性因素為自變量，根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)得到的穩(wěn)定點(diǎn)，將每個(gè)因素設(shè)置1、0、-1 三個(gè)水平（見表4）。響應(yīng)面標(biāo)繪在一個(gè)k（k=2）維的空間里，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)位點(diǎn)如圖2所示，其設(shè)計(jì)中基本水平位點(diǎn)單位為+1和-1，原點(diǎn)O取在設(shè)計(jì)中點(diǎn)（0水平）；中心補(bǔ)充點(diǎn)位數(shù)目為（2k+1），即其中一個(gè)在中心處，其余的2k個(gè)成對的在坐標(biāo)軸上分別配置在±a1，±a2，…，±ak處（a=1.414為軸線上的點(diǎn)位與中心的距離）。中心組合實(shí)驗(yàn)點(diǎn)位設(shè)計(jì)的結(jié)果見表5。

表3 爬坡路徑的計(jì)算和實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The count and experience results of steepest ascent

表4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素和水平Tab.4 Range of different factor invested in RSM

圖2 兩因素中心組合實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ虵ig.2 The modle of CCD design of two factors

表5 中心組合響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.5 CCD design and response value

根據(jù)表5設(shè)計(jì)表格配制不同培養(yǎng)基，按照方法“1.8”測得響應(yīng)值Y。采用Design expert 7.13軟件，選擇顯著性較高的模型做回歸擬合，結(jié)果如表6所示。選擇Quadratic模型（P＜0.001，R2=0.944 8，AdjustedR2=0.905 4），進(jìn)一步由該軟件直接得到影響HS-A38菌體發(fā)酵濃度的回歸方程：

2.5 響應(yīng)面分析和各組分最佳濃度的確定

利用Design expert 7.13軟件對回歸模型的可靠性進(jìn)行分析。由表7可知，整個(gè)模型的P=0.000 3，失擬項(xiàng)不顯著（Lack of fit=0.225 1），說明回歸方程達(dá)到了較好的擬合程度。在此情況下，是顯著性的，并且決定次數(shù)R2=0.944 8，說明在回歸方程中自變量可以94.48%的解釋因變量的結(jié)果。原因一方面是無法避免實(shí)驗(yàn)過程中的隨機(jī)誤差；另一方面，影響菌體濃度的因素很多，其他未被考慮的因素，比如各種培養(yǎng)條件，它們之間的交互作用可能引起結(jié)果的波動［11］。

表6 不同來源的模型參數(shù)結(jié)果Tab.6 The results of parameters from different models

表7 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.7 ANOVA results of factors and model in the response surface experiment

再利用Design expert 7.13繪出響應(yīng)面和對應(yīng)的等高線圖，如圖3所示。由左圖曲面可知曲面存在最高的點(diǎn)A，即響應(yīng)值最大時(shí)所對應(yīng)的曲面上的點(diǎn)，該點(diǎn)投影在等高線圖上的點(diǎn)為A′，根據(jù)回歸方程求一階偏導(dǎo)得到X1=8.49，X6=0.053，預(yù)測值為1.64×109cfu/mL，在該條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到的平均值為1.61×109cfu/mL，這與模型基本吻合，說明設(shè)計(jì)合理，并且與初始發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵濃度相比提高了1倍多。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面分析，確定了影響菌株HS-A38發(fā)酵菌體濃度顯著性因素葡萄糖和ZnSO4質(zhì)量濃度，并且建立了顯著的回歸方程，可用于生產(chǎn)預(yù)測。

發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后的最佳組成為葡萄糖8.49g/L，豆粕粉12.0g/L，尿素0.625g/L，酵母膏4.0g/L，K2HPO44.0g/L，ZnSO40.053g/L。優(yōu)化后，發(fā)酵菌體濃度比優(yōu)化前提高了1倍多，即從7.40×108cfu/mL提高到1.64×109cfu/mL。這為將菌株HS-A38開發(fā)成水產(chǎn)益生菌制劑奠定了基礎(chǔ)。

圖3 活菌數(shù)Y=f（X1，X6）響應(yīng)面立體分析圖及相應(yīng)等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour plot of the function Y=f（X1，X6）