曲榮榮，張春枝

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引言

巖藻黃素是可食用褐藻中一種主要的淡黃褐色的脂溶性類(lèi)胡蘿卜素，它具有很長(zhǎng)的共軛雙鍵，并含有丙二烯，乙酰基和環(huán)氧烷的特殊分子結(jié)構(gòu)［1］。這些特殊的結(jié)構(gòu)決定了巖藻黃素具有許多重要的生物活性，如抗癌［2-4］、抗炎［5］、減肥［6］以及提高免疫力［7］等。

在工業(yè)生產(chǎn)中利用微生物分泌的多種酶類(lèi)破壞組織中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞破碎，從而提高類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量的技術(shù)已有報(bào)道［8］。本實(shí)驗(yàn)以新鮮海帶為原料，通過(guò)對(duì)海帶發(fā)酵條件的研究，求得一個(gè)比較優(yōu)化的發(fā)酵工藝，以期在巖藻黃素的生產(chǎn)過(guò)程中提高產(chǎn)率。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

新鮮海帶，黑曲霉，米曲霉，納豆菌，乙醇。

722G 可見(jiàn)分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋，臺(tái)式高速離心機(jī)，HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱，766-5型遠(yuǎn)紅外快速干燥箱，HH·BII·600-Ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 種子液培養(yǎng)

1.2.1 黑曲霉和米曲霉種子液的培養(yǎng)

挑取2～3環(huán)活化的黑曲霉和米曲霉霉菌菌種，分別裝入50mL的查氏液體培養(yǎng)基于250mL的三角瓶（帶玻璃珠）中，28 ℃、160r/min搖瓶培養(yǎng)48h。

1.2.2 納豆菌種子液的培養(yǎng)

挑取2～3環(huán)活化的納豆菌菌種，裝入50mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基于250mL 的三角瓶中，37 ℃、150r/min搖瓶培養(yǎng)24h。

1.3 固體發(fā)酵

1.3.1 發(fā)酵菌種的選擇

采用實(shí)驗(yàn)室活化的3種不同的菌種：黑曲霉、米曲霉和納豆菌，分別在各自的最適生長(zhǎng)溫度下對(duì)新鮮海帶進(jìn)行發(fā)酵，其流程如下：

新鮮海帶粉碎→稱(chēng)取一定量海帶→接種培養(yǎng)→取樣→干燥（40 ℃）→研磨→提取→測(cè)吸光值。

1.3.2 發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化

新鮮的海帶渣接入8%的納豆菌，在37 ℃的條件下發(fā)酵1、2、3、4、5d，提取后測(cè)吸光值。

1.3.3 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

新鮮的海帶渣接入8%的納豆菌，分別在25、30、35、37、40、45 ℃的條件下發(fā)酵3d，提取后測(cè)吸光值。

1.3.4 接種量的優(yōu)化

新鮮的海帶渣分別接入2%、4%、6%、8%、10%的納豆菌，并在37℃的條件下發(fā)酵3d，提取后測(cè)吸光值。

1.4 巖藻黃素提取率測(cè)定［8］

稱(chēng)取適量的發(fā)酵海帶干粉，用60%的乙醇溶液，在50 ℃的條件下，以料液比1∶10 浸提1.5h，離心，取上清液，在445nm 下測(cè)吸光值。

式中，A445為樣品在445nm處的吸光值；A11cm為在1cm 光程長(zhǎng)的比色皿中1g/L 巖藻黃素的理論吸收值，即1 600；n為稀釋倍數(shù)；V為提取液總體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.5 不同處理方法對(duì)巖藻黃素提取率的影響

將海帶原料分別進(jìn)行3種不同的處理，即不采取任何處理；采用40 min、50 Hz超聲波法處理；采用最佳發(fā)酵條件發(fā)酵處理。然后用分光光度法分別測(cè)其巖藻黃素的提取率。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵菌種的選擇

由于巖藻黃素是一種極不耐熱的物質(zhì)，所以原料不采取滅菌處理。本實(shí)驗(yàn)將新鮮海帶分別接入相同量的黑曲霉、米曲霉和納豆菌在各自最適溫度下培養(yǎng)，其巖藻黃素提取率見(jiàn)表1。

表1 不同菌種發(fā)酵后巖藻黃素提取率的比較Tab.1 The comparison of fucoxanthin extract rate by different microbial strain after fermentation

由表1可見(jiàn)，不接菌的海帶原料中巖藻黃素提取率隨著天數(shù)的延長(zhǎng)而增加，這可能是由于海帶中原有的微生物經(jīng)生長(zhǎng)繁殖后參與了發(fā)酵過(guò)程，從而導(dǎo)致巖藻黃素提取率的升高。

從發(fā)酵菌種來(lái)看，納豆菌發(fā)酵的海帶中巖藻黃素提取率較黑曲霉和米曲霉處理的均有所升高，因此納豆菌為最佳發(fā)酵菌種。

2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)巖藻黃素提取率的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)固態(tài)發(fā)酵的活菌數(shù)有較大影響。發(fā)酵時(shí)間過(guò)短，細(xì)菌菌體沒(méi)有充分形成，活菌數(shù)比較少；發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不僅菌體活力會(huì)下降，而且菌體還會(huì)自溶死亡，使活菌數(shù)降低，對(duì)發(fā)酵不利。由圖1可見(jiàn)，納豆菌發(fā)酵3d后，巖藻黃素提取率達(dá)到最大值，發(fā)酵3d后有小幅下降。因此選擇3d為海帶固態(tài)發(fā)酵的最佳時(shí)間。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)巖藻黃素提取率的影響Fig.1 Effect of fermentation time on fucoxanthin extraction rate

2.3 發(fā)酵溫度對(duì)巖藻黃素提取率的影響

對(duì)于同一微生物來(lái)說(shuō)，不同的生理生化過(guò)程有著不同的最適溫度，而溫度又是微生物生長(zhǎng)代謝的重要條件，因此在發(fā)酵系統(tǒng)中必須保證合適的溫度環(huán)境。由圖2可見(jiàn)，溫度從25℃不斷上升時(shí)，巖藻黃素的提取率不斷增加，當(dāng)上升至37 ℃時(shí)達(dá)到最大值，然后隨著溫度的上升，巖藻黃素提取率開(kāi)始急劇下降?？梢?jiàn)，發(fā)酵溫度為37 ℃較好。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)巖藻黃素提取率的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on fucoxanthin extraction rate

2.4 接種量對(duì)巖藻黃素提取率的影響

由圖3可見(jiàn)，在相同發(fā)酵條件下和接種量為2%～8%范圍內(nèi)，巖藻黃素提取率隨接種量的增大而增大，且在接種量為8%時(shí)，巖藻黃素提取率達(dá)到最大，此后開(kāi)始下降，說(shuō)明接種量大于8%時(shí)不利于納豆菌的固態(tài)生長(zhǎng)和發(fā)酵。因此本實(shí)驗(yàn)的最佳接種量為8%。

圖3 接種量對(duì)巖藻黃素提取率的影響Fig.3 Effect of inoculum volume on fucoxanthin extraction rate

2.5 不同處理方法對(duì)巖藻黃素提取率的影響

由圖4可見(jiàn)，超聲波處理過(guò)的海帶較不經(jīng)處理的海帶巖藻黃素提取率有所升高，說(shuō)明通過(guò)破壁方法能夠使巖藻黃素得到更有效的提取，發(fā)酵后的海帶較未經(jīng)處理的海帶巖藻黃素提取率明顯提高，其提取率增加了1.05倍，因而發(fā)酵法是一種提高巖藻黃素提取率的有效方法。

圖4 3種不同處理方法對(duì)巖藻黃素提取率的比較Fig.4 Comparison of three different treatment methods on fucoxanthin extraction rate

3 結(jié)論

（1）海帶中的巖藻黃素經(jīng)納豆菌發(fā)酵的提取率較黑曲霉和米曲霉均有所升高，因此采用納豆菌為最佳發(fā)酵菌種。

（2）通過(guò)本實(shí)驗(yàn)得出納豆菌固態(tài)發(fā)酵海帶的最適條件為：接種量8%，37 ℃固態(tài)發(fā)酵3d。

（3）經(jīng)納豆菌發(fā)酵后海帶中的巖藻黃素提取率為1.03mg/g，與直接提取法相比巖藻黃素提取率明顯增加，且增加了1.05倍。