浦光瑞，張 虹

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科，遼寧大連 116011)

口腔扁平苔蘚中MMP-2和MMP-9的表達(dá)及意義

浦光瑞，張 虹

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科，遼寧大連 116011)

［目的］探索MMP-2和MMP-9與口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP)的發(fā)生、發(fā)展乃至癌變潛能的關(guān)系。［方法］采用免疫組化SP法檢測MMP-2和MMP-9在22例OLP、11例正?？谇火つそM織、22例白斑和22例口腔鱗癌組織表達(dá)。［結(jié)果］在正?？谇火つぁ⒈馄教μ\、白斑和鱗癌組織中MMP-2和MMP-9的表達(dá)依次增加。MMP-2和MMP-9在口腔扁平苔蘚和白斑中的表達(dá)顯著高于正?？谇火つ?(P＜0.05)，但在口腔扁平苔蘚和白斑間的表達(dá)差異無顯著性意義(P＞0.05);在鱗癌中的表達(dá)顯著高于其他3組 (P＜0.05)。［結(jié)論］MMP-2和MMP-9表達(dá)與OLP的發(fā)生、發(fā)展乃至癌變潛能有關(guān)。

基質(zhì)金屬蛋白酶2;基質(zhì)金屬蛋白酶9;扁平苔蘚;口腔

口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP)是發(fā)生在口腔黏膜的一種慢性、淺表性炎癥損害，因其長期糜爛有惡變傾向，WHO將其列入癌前狀態(tài)，癌變率在1%左右［1］。其病因和癌變原因目前仍不明了。臨床對于判斷OLP是否發(fā)生癌變主要依靠光鏡下的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，因此從分子水平上探尋有助于判斷病變組織良惡性程度的標(biāo)記物已成為口腔醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)?；|(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinase，MMPs)能夠特異性的降解基底膜的成分。基底膜中最主要的穩(wěn)定成分是Ⅳ型膠原，只有Ⅳ型膠原酶能降解Ⅳ型膠原，破壞基底膜的完整性。MMPs中的明膠酶是惟一能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluar matix，ECM)和基底膜(basement membrane，BM)中IV型膠原的酶，它包括MMP-2和MMP-9，其作用底物幾乎覆蓋了所有基底膜成分，是研究基底膜損傷最重要的一組酶［2］。本實驗采用免疫組化法，檢測MMP-2和MMP-9在OLP中的表達(dá)，并用正?？谇火つ?normal oral mucosa，NOM)、白斑(oral leukoplakia，OLK)和口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)作對照，研究MMP -2和MMP-9與OLP的發(fā)生發(fā)展乃至癌變潛能的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

選取大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科2009—2010年經(jīng)病理科確診的22例OLP患者的病變黏膜組織為研究對象，以11例NOM(腫瘤邊界1 cm外的癌旁組織來源于拔牙患者、外傷患者和唇腭裂患者)，22例OLK和22例OSCC對照?；颊呔橥?。

1.2 實驗試劑

兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2多克隆抗體和兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶9多克隆抗體(中杉金橋試劑公司);快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品);檸檬酸組織修復(fù)液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品);DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品)

1.3 實驗方法

組織經(jīng)10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，10 μm厚連續(xù)切片。3%雙氧水孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，1%檸檬酸于高壓鍋內(nèi)抗原熱修復(fù)2 min，5%正常牛血清孵育15 min以阻斷非特異背景反應(yīng);滴加一抗，室溫孵育60 min;滴加即用型快捷免疫組MaxVision試劑，室溫孵育20 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，封片。

1.4 結(jié)果判定

采用獨(dú)立雙盲法觀察結(jié)果，用PBS代替一抗作為陰性對照。染色陽性以細(xì)胞漿或胞膜呈現(xiàn)棕黃至棕褐色為標(biāo)準(zhǔn)，按半定量方法判定其表達(dá)強(qiáng)度(按照參照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行評分)。根據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度分為:無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;每張切片隨機(jī)選擇10個400倍視野計算細(xì)胞總數(shù)和陽性表達(dá)的細(xì)胞個數(shù)，得出細(xì)胞表達(dá)百分率:無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)占1% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，﹥75%為4分。兩項結(jié)果相加:0～2分為陰性，≥3分者為MMP-2和MMP-9陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件。各組陽性率差異比較采用行×列χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

MMP-2在NOM染色較淺大多呈陰性表達(dá);OLP和OLK中在上皮基底層陽性表達(dá);在OSCC陽性表達(dá)顯著增強(qiáng)，在基底膜附近的腫瘤細(xì)胞和癌巢染色更為明顯，癌巢周圍間質(zhì)也有中等程度的染色(表1、圖1)。MMP-9在NOM染色較淺大多呈陰性表達(dá);OLP中主要在上皮基底層陽性表達(dá)，還有少量在固有層的炎性浸潤細(xì)胞陽性表達(dá);OLK中在上皮基底層陽性表達(dá);在OSCC陽性表達(dá)顯著增強(qiáng)，在基底膜附近的腫瘤細(xì)胞和癌巢染色更為明顯，癌巢周圍間質(zhì)也有中等程度的染色(表2、圖2)。

表1 MMP-2在NOM、OLP、OLK和OSCC中表達(dá)的細(xì)胞數(shù)比較Tab 1 The expression of MMP -2 in NOM、OLP、OLK and OSCC in cell number comparison (n)

表2 MMP-9在NOM、OLP、OLK和OSCC中表達(dá)的細(xì)胞數(shù)比較Tab 2 The expression of MMP -9 in NOM、OLP、OLK and OSCC in cell number comparison (n)

在OLP、OLK、OSCC中 MMP-2和 MMP-9的表達(dá)依次增強(qiáng)，且與NOM比較差異均有顯著性意義(P＜0.05)。OLP和OLK兩組之間比較差異無顯著性意義(P＞0.05)，但與OSCC比較差異均有顯著性意義(P ＜0.05)。

3 討 論

基底膜改變是OLP病損的特征學(xué)改變，損傷的基底膜一旦失去了支撐作用，基底細(xì)胞就會脫落，導(dǎo)致發(fā)生基底細(xì)胞的液化變性，因此基底膜的損傷在口腔扁平苔蘚發(fā)病中有很重要作用。Ⅳ型膠原是基底膜中最主要成分，其數(shù)量減少或功能異常時可影響基底膜的生理功能及細(xì)胞功能，也是腫瘤細(xì)胞浸潤擴(kuò)散過程中的一道天然屏障［4］。

本研究中MMP-2和MMP-9在NOM有很少量表達(dá)，并與OLP差異有顯著性意義(P＜0.05)。這可能是一種正常生理狀態(tài)下的持續(xù)弱陽性表達(dá)，正常組織通過嚴(yán)格調(diào)控MMP-2和MMP-9基因的正常表達(dá)來維持與它們各自的特異性抑制劑TIMP-2和TIMP-1之間的平衡，從而使基底膜的合成和降解達(dá)到了平衡穩(wěn)定狀態(tài)［5］。

MMP-2和MMP-9在OLP中的陽性表達(dá)低于OLK，這與OLP沒有上皮異常增生而OLK有上皮異常增生的病理特征相吻合。但兩組間差異無顯著性意義，原因可能是實驗樣本例數(shù)不足或選取的OLK組織異常增生的程度較輕。從OLP、OLK至OSCC中MMP-2和MMP-9的陽性表達(dá)率依次增加，說明兩者在有異常增生上皮組織中的表達(dá)強(qiáng)于無異常增生組織(OLK和OSCC高于OLP)，且隨著異常增生程度的加重而表達(dá)增強(qiáng)。MMP-2和MMP-9在OLP的陽性表達(dá)介于NOM和OSCC之間，并且差異有顯著性意義，說明口腔扁平苔蘚尚未進(jìn)展到癌，但仍具有一定的癌變傾向，這為解釋臨床上大多數(shù)口腔扁平苔蘚生物學(xué)行為較好，僅有極少部分病例不斷發(fā)展甚至癌變提供了一定的理論依據(jù)。

本實驗在OLP中MMP-9的陽性細(xì)胞還有少部分在炎性浸潤的黏膜固有層中表達(dá)，其原因可能有兩點(diǎn):一是抗原特異性的CD8+T淋巴細(xì)胞可以分泌MMPs和它們的抑制劑(tissue Inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)，在OLP固有層的炎性浸潤組織中，兼有MMP-9和TIMP-1mRNA表達(dá)能力的T細(xì)胞在受到細(xì)胞因子的刺激后，使 T細(xì)胞表達(dá)MMP-9mRNA的水平升高，而TIMP-1則缺乏這種變化，導(dǎo)致MMP-9與TIMP-1之間平衡失調(diào)，因MMP-9相對于TIMP-1的過表達(dá)，使TIMP-1抑制MMP-9的作用減弱，從而MMP-9的降解作用增強(qiáng)。二是MMP-9激活以后，降解了的基底膜，還可以使更多的T細(xì)胞沿著基底膜缺損處進(jìn)入上皮而加劇上皮基底膜的損傷［6］，T細(xì)胞穿過基底膜的遷移活動和T細(xì)胞衍生的MMPs有關(guān)。Smllor等［7］實驗證明浸潤的T淋巴細(xì)胞可以引起基底膜的損傷，損傷的基底膜又可以加重扁平苔蘚的病理改變。Sugerman等［8］認(rèn)為抗原特異性和非特異性機(jī)制均可引起基底膜的損傷，兩種機(jī)制的共同歸宿就是MMPs引起基底膜的損傷。由此推測T細(xì)胞來源的MMP-9可能參與了OLP的發(fā)病。

有研究表明角質(zhì)形成細(xì)胞需要基底膜衍生細(xì)胞的存活信號來阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此推測本實驗中在MMP-2和MMP-9導(dǎo)致OLP上皮基底膜的破壞之后，損壞的基底膜無法提供生存信號給角質(zhì)形成細(xì)胞，從而繼發(fā)角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，而凋亡的角質(zhì)形成細(xì)胞分泌基底膜結(jié)構(gòu)蛋白的能力大大降低，不能修復(fù)受損基底膜，使基底膜的損傷加劇。所以，基底膜的損傷與其繼發(fā)引起的角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡，兩種過程相互促進(jìn)，導(dǎo)致OLP的慢性進(jìn)程。

本實驗中MMP-2和MMP-9在OSCC的陽性表達(dá)顯著高與其他3組，其原因可能是在OSCC中MMP-2和MMP-9在腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中均有分布，并在癌巢周邊表達(dá)明顯增多，提示癌巢邊緣細(xì)胞增生活躍，能誘導(dǎo)MMP-2和MMP-9的產(chǎn)生，降解細(xì)胞外基質(zhì)和癌巢基底膜，因而具有較高的侵襲潛能;但在OLP和白斑中主要定位于上皮細(xì)胞中，間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)很少，提示MMP-2和MMP-9的激活是參與細(xì)胞癌變的因素之一，當(dāng)細(xì)胞癌變后，腫瘤細(xì)胞能分泌或誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞分泌大量的MMP-2和MMP-9，破壞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解平衡，從而促進(jìn)癌細(xì)胞突破基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的組織學(xué)屏障，侵襲周圍組織和深層組織，重新塑造局部微環(huán)境［9］，達(dá)到侵襲和轉(zhuǎn)移的目的。Jordan等［10］曾報道MMPs可能是口腔上皮異常增生惡性轉(zhuǎn)化的一個有用指標(biāo)，其可能的機(jī)制是MMP和P53的突變存在聯(lián)系。

本研究提示，MMP-2和MMP-9在OLP中的表達(dá)上調(diào)是其發(fā)生發(fā)展乃至癌變的分子基礎(chǔ)，MMP-2和MMP-9的水平變化有可能成為扁平苔蘚的診斷、預(yù)后和判斷癌變的動態(tài)指標(biāo)之一。此外TIMPs可以抑制MMPs的活性，在正常生理狀態(tài)下MMPs與TIMPs協(xié)同產(chǎn)生而維持動態(tài)平衡，但當(dāng)此平衡被打破時，ECM和BM的代謝異?？蓪?dǎo)致疾病的發(fā)生并促進(jìn)惡化。

:

［1］賀東暾，董旭，陳蓉.口腔扁平苔蘚癌變臨床觀察［J］.中國誤診學(xué)雜志，2004，4(1):881.

［2］金曉明，李雅馨.血管內(nèi)皮生長因子對口腔鱗癌細(xì)胞系基質(zhì)金屬蛋白酶-2和-9活性的影響［J］.口腔醫(yī)學(xué)，2004，24(2):65 -67.

［3］Shimizu M，Saitoh Y，Itoh H.Immunohistochemical staining of Haras oncogene product in normal，benign，and malignant human pancreatic tissues［J］.Hum Pathol，1990，21(6):607-612.

［4］馬軍花，于芹芹.IV型膠原、MMP-2及TIM P-2在妊高征胎盤組織中的表達(dá)及意義［J］.山東醫(yī)藥，2007，47(11):45-46.

［5］李文薈，郭莉，譚耀文，等.口腔癌及癌前病變組織中MMP-9基因表達(dá)的意義［J］.臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志，2007，23(1):27 -28.

［6］Xijing J，Philip B.Intra2epithelial CD8 + Tcells and basement membrane disruption in oral lichen plans［J］.J Oral Pathol Med，2002，31:1 -23.

［7］Smllor BR，Schach CP，Hudson AR，et al.Immunohistochemical stains in dermatopathology［J］.American J Dermatol，2000，43(6):1094 -1100.

［8］Sugerman PB.Disease mechanism in oral lichen planus:a possible role for autoimmunity［J］.Australia J Dermatol，1993，34(2):63 -69.

［9］Vaalamo M，Mattila L，Johansson N，et al.Distinct populations of stromal cells express collagenase-3(MMP-13)and collagenase-1(MMP-1)in chronic ulcers but not in normally healing wounds［J］.J Invest Dermatol，1997，109:96.

［10］Jordan RC，Macabeo-Ong M，Shiboski CH，et al.Overexpression of matrix metalloproteinase-1 and-9 mRNA is associated with progression of oral dysplasia to cancer［J］.Clin Cancer Res，2004，10:6460 -6465.

Expression and significance of oral lichen planus in MMP-2 and MMP-9

PU Guang-rui，ZHANG Hong
(Department of Stomatology，the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116011，China)

Abstract:［Objective］To Explore the relationshiops of MMP-2 and MMP-9 to the OLP occurrence，the development and even the canceration potential.［Methods］Immunohisto- chemistry was performed to examine expressions of MMP -2 and MMP -9 in 22 OLP，11 normal oral mucosa，22 oral leukoplakia and 22 squamous cell carcinoma.［Results］The expression of MMP-2 and MMP-9 increased in turn from normal oral mucosa to OLP，oral leukoplakia and oral squamous cell carcinoma tissues.The expression of MMP-2 and MMP-9 in OLP and oral leukoplakia was significantly higher than that in normal oral mucosa(P＜0.05)，there was significant difference;There was no significant difference between the positive expression of MMP-2 and MMP-9 in OLP and oral leukoplakia(P＞0.05);The expression of MMP-2 and MMP-9 in squamous cell carcinoma was significantly higher than The other three groups(P＜0.05)，there was significant difference.［Conclusion］The expression levels of MMP-2 and MMP-9 correlate with the occurrence of oral lichen planus，development and even cancer potential，which may be useful indicator to judge the possibility of malignant change of OLP.

Key words:matrix metalloproteinase-2;matrix metalloproteinase-9;lichen planus;oral

R781.5+9

A

1671-7295(2012)05-0446-04

2012-04-18;

2012-08-10

浦光瑞(1982-)，女，遼寧大連人，主治醫(yī)師。E-mail:puguangruiliu@sina.com