胡小勤，陳利國，曾學文，戴勇，張敏

(1.廣西中醫(yī)學院，廣西 南寧 530001;2.暨南大學醫(yī)學院，廣東 廣州 510632;3.廣東南海市中醫(yī)院，廣東 佛山 528200)

血瘀證與血管內皮細胞損傷密切相關［1］，因此通過體外實驗觀察血瘀證患者血清對人臍靜脈內皮細胞CRL－1730活性的影響，并與非血瘀證患者血清的作用進行比較，可深入探討血瘀證形成的病理機制。本實驗研究了高血壓病血瘀證患者血清對CRL－1730活性的影響。

1 材料

1.1 細胞來源 人臍靜脈內皮細胞株(CRL－1730)由美國ATCC公司提供。

1.2 試劑 F12K培養(yǎng)基、內皮細胞生長因子(ECGS)(北京邁晨科技公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所);胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(Gibco公司);青霉素、鏈霉素(華北制藥股份有限公司)。

1.3 儀器 680型酶標儀(美國Bio－Rad公司)。

2 方法

2.1 血清來源 選取高血壓病血瘀證和非血瘀證患者各20例，為2005年5月～2006年5月廣州華僑醫(yī)院門診及住院確診者。高血壓病診斷符合世界衛(wèi)生組織/國際高血壓學會統(tǒng)一的診斷標準［2］。血瘀證診斷符合1986年中國中西醫(yī)結合研究會制定的血瘀證診斷標準［3］。兩組患者均為原發(fā)性高血壓患者，排除靶器官損害或糖尿病。兩組患者在性別、年齡、血壓分級方面無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，具有可比性。健康組選擇暨南大學本科生健康志愿者15人。其血壓在正常范圍，與高血壓病患者血壓比較，有統(tǒng)計學差異(P ＜0.01)。

2.2 血清收集 高血壓病血瘀證患者、非血瘀證患者及健康人均空腹取血，置入不抗凝干燥試管，自凝后以2 000r/min離心(4℃，15min)，取上清液置無菌 EP管，凍存于－20℃，備用。用于體外細胞實驗的血清分別為各組患者的混合血清。

2.3 分組

2.3.1 對照組 100%DMEM。

2.3.2 血瘀組 分別為5%，10%，15%，20%血瘀證患者血清(DMEM稀釋)。

2.3.3 非血瘀組 分別為5%，10%，15%，20%非血瘀證患者血清(DMEM稀釋)。

2.3.4 健康組 分別為5%，10%，15%，20%健康人血清(DMEM稀釋)。

2.4 細胞接種及活性觀察 按1×105個/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板中，100μL/孔。培養(yǎng)24h后，換無血清培養(yǎng)液再培養(yǎng)24h，按血瘀組、非血瘀組、健康組各4組(5%，10%，15%，20%)及對照組分組，每組8個復孔，繼續(xù)分別培養(yǎng) 6，12，24，48h 后，每孔加入 20μL MTT(5g/L)，孵育 4h，傾去上清液，每孔加 DMSO 150μL，振蕩10min，全自動酶標儀于570nm處測定吸光度(A)。以空白對照孔調零。

3 結果

MTT法檢測細胞活性，不同濃度血清作用于CRL－1730不同時間后細胞活性比較，見表1～4。

表1 血清作用CRL－1730 6h后細胞活性比較(±s，n=8)

表1 血清作用CRL－1730 6h后細胞活性比較(±s，n=8)

注:與健康組比較，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01。

A組別20% 15% 10% 5%血瘀組 0.68 ±0.142)0.66 ±0.062) 0.73 ±0.06 0.77 ±0.102)非血瘀組 0.76 ±0.062)0.61 ±0.072) 0.73 ±0.03 0.72 ±0.082)健康組1.01 ±0.16 0.92 ±0.06 0.98 ±0.09 1.12 ±0.03

由表1可見，血清作用6小時后，血瘀組、非血瘀組與健康組比較，20%，15%和5%濃度時差異顯著(P＜0.01);血瘀組與非血瘀組比較，無統(tǒng)計學差異。

表2 血清作用CRL－1730 24h后細胞活性比較(±s，n=8)

表2 血清作用CRL－1730 24h后細胞活性比較(±s，n=8)

注:與健康組比較，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01。

A組別20% 15% 10% 5%血瘀組 0.86 ±0.11 0.88 ±0.182)0.98 ±0.052)0.93 ±0.072)非血瘀組 0.95 ±0.10 0.90 ±0.172)1.01 ±0.032)1.05 ±0.131)健康組0.99 ±0.10 1.32 ±0.08 1.51 ±0.17 1.94 ±0.14

表3 血清作用CRL－1730 48h后細胞活性比較(±s，n=8)

表3 血清作用CRL－1730 48h后細胞活性比較(±s，n=8)

注:與健康組比較，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01。

A組別20% 15% 10% 5%血瘀組 1.11 ±0.08 1.37 ±0.021) 1.40 ±0.13 1.38 ±0.072)非血瘀組 1.23 ±0.10 1.35 ±0.041) 1.44 ±0.04 1.42 ±0.102)健康組1.23 ±0.05 1.57 ±0.03 1.47 ±0.07 1.83 ±0.06

由表2可見:血清作用24小時后，血瘀組、非血瘀組與健康組比較，15%，10%和5%濃度時差異顯著(P＜0.05或P＜0.01);血瘀組與非血瘀組比較，無統(tǒng)計學差異。

從表3可見，血清作用48小時后，血瘀組、非血瘀組與健康組比較，15%和5%濃度時差異顯著(P＜0.05或P＜0.01);血瘀組與非血瘀組比較，無統(tǒng)計學差異。

總的來說，血清作用6h后，血瘀組、非血瘀組與健康組比較，細胞活性較低，20%，15%和5%濃度時差異顯著(P＜0.01);血清作用24h后，血瘀組、非血瘀組與健康組比較，細胞活性較低，15%，10%和5%濃度時差異顯著(P＜0.05或P＜0.01);血清作用48h后，血瘀組、非血瘀組與健康組比較，細胞活性較低，15%和5%濃度時差異顯著(P＜0.05或P＜0.01);各濃度血清作用6，24，48h后，血瘀組與非血瘀組比較，均無統(tǒng)計學差異，但血瘀組細胞活性較非血瘀組有降低的趨勢。

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，血清作用24，48h，血瘀組、非血瘀組細胞活性較健康組低，在某些濃度時差異顯著(P＜0.05或 P ＜0.01)，與文獻報道結果一致［4－5］。本研究也說明，血瘀證患者血清可以降低血管內皮細胞的活性，但要選擇合適的作用時間及合適的濃度。而血瘀組和非血瘀組比較，無統(tǒng)計學差異，但血瘀組細胞活性較非血瘀組有降低的趨勢，說明高血壓病患者血清可以降低內皮細胞的活性，對細胞的代謝與增殖有抑制作用。其中，血瘀證患者血清對細胞活性的抑制有更明顯的趨勢。之所以還沒有統(tǒng)計學差異，可能是因為血清的作用沒有持續(xù)，下一步如果對損傷的細胞進行傳代，并繼續(xù)用血清進行干預，可能會得出不一樣的結論。

［1］ 李曉，姜萍.血管內皮細胞損傷與血瘀證［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，2000，20(2):154 －156.

［2］ Chalmers J，Chusid P，Cohan JN，et al.WHO － ISH hypertension guidelines committee.1999 world health organization － international society of hypertension guidelines for the management of hypertension［J］.J Hypertension，1999，17:151 －183.

［3］ 中國中西醫(yī)結合研究會活血化瘀專業(yè)委員會.血瘀證診斷標準［J］.中西醫(yī)結合雜志，1987，7(3):129.

［4］ 李正飛，郝斌，楊濤，等.氟伐他汀對抗磷脂綜合征患者血清誘導人臍靜脈內皮細胞細胞間黏附分子－1表達的影響及機制［J］.中國藥物與臨床，2010，10(4):418.

［5］ 李小麗，甘華，常曉東，等.尿毒癥患者血清對內皮細胞凋亡的影響及rhEPO的干預作用［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2009，31(22):2255.