朱祥 馬圭 祁衛(wèi)東 蔣鵬程 范鈺

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院腫瘤研究所 江蘇鎮(zhèn)江 212002）

Cripto－1基因最初是通過克隆人畸胎瘤細(xì)胞系中的互補(bǔ)DNA文庫得到，故相應(yīng)地命名為畸胎瘤衍生生長因子－1（teratocarcinoma－derived growth factor－1，TDGF1），定位在人類染色體3p21.3［1］，編碼cripto蛋白，故一般稱為Cr－1基因。研究發(fā)現(xiàn)，Cr－1基因在許多惡性實(shí)體瘤如結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、陰莖癌、膀胱癌及前列腺癌等中均呈過度表達(dá)，而它在正常組織中都不表達(dá)或低表達(dá)［2，3］。有研究發(fā)現(xiàn)，Cr－1基因與某些腫瘤如結(jié)直腸癌［4～8］侵襲有關(guān)。但國內(nèi)目前尚無關(guān)于此基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲方面的研究。

本課題組借助于RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)，以化學(xué)合成Cr－1基因小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染處理結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，觀察了Cr－1基因siRNA轉(zhuǎn)染對癌細(xì)胞侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，本院組織生物標(biāo)本庫凍存。Cr－1抗體購自Santa Cruz公司。TRIzol，RNase inhibitor，逆轉(zhuǎn)錄酶SSRTⅡ，Taq酶和轉(zhuǎn)染試劑Oligofectamine購自Invitrogen公司。

1.1.2 siRNA序列 根據(jù)Cr－1基因mRNA序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了6個(gè)siRNA。另外，設(shè)計(jì)了一個(gè)錯(cuò)配 siRNA（正義 鏈：5＇－UUCUCCGAACGUGUCACGUTdTd－3 ＇； 反 義 鏈： 5 ＇－ACGUGACACGUUCGGAGAATdTdT－3＇）作為對 照。所有siRNA均由美國Dharmacon公司采用化學(xué)合成方法合成。Cripto－1siRNA序列見表1。

表1 Cripto－1siRNA 序列

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染處理 人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液、37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境的條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1天，將1.0×105對數(shù)期生長的細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，1ml／well，培養(yǎng)過夜。次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染?；静僮靼凑f明書進(jìn)行。細(xì)胞分組：（1）空白對照組（Con－A）：未經(jīng)任何處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞；（2）空載對照組（Con－B）：即脂質(zhì)體對照組；（3）錯(cuò)配對照組（Scr－siRNA）；（4）siRNA 組：10%胎牛血清的 RBMI 1640中含不同濃度（3.125、6.25、12.5nmol／L）的已用脂質(zhì)體包埋的siRNA。

1.2.2 結(jié)直腸癌細(xì)胞Cr－1基因檢測

1.2.2.1 mRNA水平 采用熒光實(shí)時(shí)定量RTPCR檢測。收集細(xì)胞，以TRIzol抽提細(xì)胞總RNA，取總RNA 1μg，以oligo dT（15mer）為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以此cDNA鏈2μL為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，步驟參照說明書進(jìn)行。Cripto－1定量 PCR 引物：上游：5＇－CAATTCGGCCTCGGTCTTC－3＇；下游：5＇－TTCAGGCAGCAGGTTCTGTTT－3＇。 FAM 探 針：5＇－CATGGGTGCCCCGACGTTGC－3＇－TAMRA。以3－磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件為：95℃，預(yù)變性3min，95℃，30s；52℃，45s；72℃，45 s；35個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸7min。

1.2.2.2 蛋白水平 采用蛋白質(zhì)印跡方法檢測。提取對照組和各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后進(jìn)行常規(guī)Western blot檢測。利用Kodak Digital Science 1DImage Analysis Software（Eastman Kodak Company，USA）測定 Western blot條帶凈灰度值，并與內(nèi)參照β－actin的測定結(jié)果相比較，計(jì)算其比值。

1.2.3 軟瓊脂集落形成試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法［9］，進(jìn)行軟瓊脂集落培養(yǎng)試驗(yàn)，觀測Cr－1siRNA對結(jié)直腸癌細(xì)胞錨著不依賴性增殖的影響。

1.2.4 體外侵襲試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法［10］，在Boyden小室模型中進(jìn)行觀察。400倍光鏡下計(jì)數(shù)穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)，以侵襲細(xì)胞的相對數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞侵襲能力。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，每組計(jì)數(shù)3份樣本。

2 結(jié) 果

2.1 Cr－1siRNA的篩選 為探討Cr－1基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲中的作用，本研究首先根據(jù)該基因mRNA序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)并用化學(xué)方法合成了3個(gè)siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量RT－PCR檢測Cr－1基因mRNA水平。結(jié)果顯示，這3個(gè)siRNA均能明顯抑制Cr－1mRNA水平，以S1效果最好，而空載對照組和錯(cuò)配對照組Cr－1mRNA水平無明顯變化（P＞0.05）（見圖1）。

圖1 Cr－1siRNA轉(zhuǎn)染對結(jié)直腸癌細(xì)胞錨著不依賴性增殖的影響

2.2 siRNA敲除對結(jié)直腸癌細(xì)胞Cr－1基因的影響 本研究進(jìn)一步采用S1siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，分別采用實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測Cr－1基因mRNA和蛋白水平。結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞比較，siRNA組Cr－1mRNA和蛋白水平明顯降低（P＜0.05，見圖2、圖3）。

圖2 siRNA對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞Cr－1mRNA水平的影響

圖3 siRNA對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞Cr－1蛋白水平的影響

2.3 Cr－1siRNA轉(zhuǎn)染對結(jié)直腸癌細(xì)胞軟瓊脂集落形成的影響 軟瓊脂集落形成試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Cr－1siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞集落生長呈劑量依賴性減少（P＜0.05，見圖4）。

圖4 Cr－1siRNA轉(zhuǎn)染對結(jié)直腸癌細(xì)胞錨著不依賴性增殖的影響

2.4 Cr－1siRNA轉(zhuǎn)染對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲的影響 采用Boyden小室模型檢測癌細(xì)胞侵襲情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，siRNA組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯下降，且與濃度相關(guān)（P＜0.05，見圖5）。

圖5 Cr－1siRNA轉(zhuǎn)染對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞體外侵襲的影響

3 討 論

在基因研究領(lǐng)域中，RNAi和siRNA已引起了廣泛的注意。RNAi是近年來發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)mRNA的生物學(xué)現(xiàn)象，能夠使基因的mRNA被相應(yīng)的雙鏈RNA分子敲除，其效果要遠(yuǎn)強(qiáng)于正義和反義RNA［11］。RNAi最主要的功能在于可以調(diào)節(jié)和關(guān)閉基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的各種高級生命活動(dòng)。而siRNA是指RNAi過程中在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的長約21～25核苷酸（nt）的小雙鏈RNA分子，是RNAi作用機(jī)制的重要中間效應(yīng)分子。而且已有人工合成的siRNA，具有明顯的敲除相應(yīng)基因mRNA的效果［10，12～14］。由于siRNA 具有高效敲除基因表達(dá)的工具，已被廣大科學(xué)工作者用來研究基因功能和基因治療的工具。

為了解Cr－1基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲中的作用，本研究根據(jù)Cr－1基因mRNA特點(diǎn)，設(shè)計(jì)siRNA序列，并用化學(xué)方法合成，轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞后，分別采用熒光實(shí)時(shí)定量RT－PCR和wetern blot方法檢測Cr－1基因mRNA和蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Cr－1基因mRNA和蛋白水平明顯下降，提示Cr－1siRNA轉(zhuǎn)染成功。說明該siRNA可作為研究Cr－1基因功能的有力工具。

接著，我們在體外觀察了Cr－1基因siRNA轉(zhuǎn)染對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞侵襲的影響。正常真核細(xì)胞，除成熟血細(xì)胞外，大多須粘附于特定的細(xì)胞外基質(zhì)上才能抑制凋亡而存活，稱為錨著依賴性（anchorage dependence）。腫瘤細(xì)胞可以錨著不依賴性狀態(tài)生長。腫瘤細(xì)胞在軟瓊脂形成集落的多少與惡性程度呈正相關(guān)。癌細(xì)胞侵襲能力強(qiáng)，則在軟瓊脂上形成的集落數(shù)目多。軟瓊脂集落培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)Cr－1siRNA轉(zhuǎn)染處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞軟瓊脂集落數(shù)和穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。

Boyden小室模型或Transwell是檢測癌細(xì)胞侵襲試驗(yàn)的經(jīng)典模型，已被廣泛應(yīng)用于探討癌細(xì)胞侵襲的相關(guān)研究中。本研究將經(jīng)Cr－1siRNA轉(zhuǎn)染處理的結(jié)直腸癌549細(xì)胞置于Boyden小室模型中，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組結(jié)直腸癌細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。提示Cr－1下調(diào)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的體內(nèi)外侵襲能力。

本研究提示，Cr－1基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲中起著重要的作用，以siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)可明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力，其內(nèi)在機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

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