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        特異性siRNA下調(diào)Cr-1基因表達(dá)對人結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲的影響

        2012-09-14 10:03:20朱祥馬圭祁衛(wèi)東蔣鵬程范鈺
        結(jié)直腸肛門外科 2012年5期
        關(guān)鍵詞:依賴性瓊脂直腸癌

        朱祥 馬圭 祁衛(wèi)東 蔣鵬程 范鈺

        (江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院腫瘤研究所 江蘇鎮(zhèn)江 212002)

        Cripto-1基因最初是通過克隆人畸胎瘤細(xì)胞系中的互補(bǔ)DNA文庫得到,故相應(yīng)地命名為畸胎瘤衍生生長因子-1(teratocarcinoma-derived growth factor-1,TDGF1),定位在人類染色體3p21.3[1],編碼cripto蛋白,故一般稱為Cr-1基因。研究發(fā)現(xiàn),Cr-1基因在許多惡性實(shí)體瘤如結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、陰莖癌、膀胱癌及前列腺癌等中均呈過度表達(dá),而它在正常組織中都不表達(dá)或低表達(dá)[2,3]。有研究發(fā)現(xiàn),Cr-1基因與某些腫瘤如結(jié)直腸癌[4~8]侵襲有關(guān)。但國內(nèi)目前尚無關(guān)于此基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲方面的研究。

        本課題組借助于RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù),以化學(xué)合成Cr-1基因小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)轉(zhuǎn)染處理結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞,觀察了Cr-1基因siRNA轉(zhuǎn)染對癌細(xì)胞侵襲的影響。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 試劑 人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞,本院組織生物標(biāo)本庫凍存。Cr-1抗體購自Santa Cruz公司。TRIzol,RNase inhibitor,逆轉(zhuǎn)錄酶SSRTⅡ,Taq酶和轉(zhuǎn)染試劑Oligofectamine購自Invitrogen公司。

        1.1.2 siRNA序列 根據(jù)Cr-1基因mRNA序列特點(diǎn),設(shè)計(jì)合成了6個(gè)siRNA。另外,設(shè)計(jì)了一個(gè)錯(cuò)配 siRNA(正義 鏈:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTdTd-3 '; 反 義 鏈: 5 '-ACGUGACACGUUCGGAGAATdTdT-3')作為對 照。所有siRNA均由美國Dharmacon公司采用化學(xué)合成方法合成。Cripto-1siRNA序列見表1。

        表1 Cripto-1siRNA 序列

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染處理 人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液、37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境的條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1天,將1.0×105對數(shù)期生長的細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板,1ml/well,培養(yǎng)過夜。次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染?;静僮靼凑f明書進(jìn)行。細(xì)胞分組:(1)空白對照組(Con-A):未經(jīng)任何處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞;(2)空載對照組(Con-B):即脂質(zhì)體對照組;(3)錯(cuò)配對照組(Scr-siRNA);(4)siRNA 組:10%胎牛血清的 RBMI 1640中含不同濃度(3.125、6.25、12.5nmol/L)的已用脂質(zhì)體包埋的siRNA。

        1.2.2 結(jié)直腸癌細(xì)胞Cr-1基因檢測

        1.2.2.1 mRNA水平 采用熒光實(shí)時(shí)定量RTPCR檢測。收集細(xì)胞,以TRIzol抽提細(xì)胞總RNA,取總RNA 1μg,以oligo dT(15mer)為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,以此cDNA鏈2μL為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,步驟參照說明書進(jìn)行。Cripto-1定量 PCR 引物:上游:5'-CAATTCGGCCTCGGTCTTC-3';下游:5'-TTCAGGCAGCAGGTTCTGTTT-3'。 FAM 探 針:5'-CATGGGTGCCCCGACGTTGC-3'-TAMRA。以3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件為:95℃,預(yù)變性3min,95℃,30s;52℃,45s;72℃,45 s;35個(gè)循環(huán)后,72℃再延伸7min。

        1.2.2.2 蛋白水平 采用蛋白質(zhì)印跡方法檢測。提取對照組和各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總蛋白,蛋白定量后進(jìn)行常規(guī)Western blot檢測。利用Kodak Digital Science 1DImage Analysis Software(Eastman Kodak Company,USA)測定 Western blot條帶凈灰度值,并與內(nèi)參照β-actin的測定結(jié)果相比較,計(jì)算其比值。

        1.2.3 軟瓊脂集落形成試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法[9],進(jìn)行軟瓊脂集落培養(yǎng)試驗(yàn),觀測Cr-1siRNA對結(jié)直腸癌細(xì)胞錨著不依賴性增殖的影響。

        1.2.4 體外侵襲試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法[10],在Boyden小室模型中進(jìn)行觀察。400倍光鏡下計(jì)數(shù)穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù),以侵襲細(xì)胞的相對數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞侵襲能力。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù),取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,每組計(jì)數(shù)3份樣本。

        2 結(jié) 果

        2.1 Cr-1siRNA的篩選 為探討Cr-1基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲中的作用,本研究首先根據(jù)該基因mRNA序列特點(diǎn),設(shè)計(jì)并用化學(xué)方法合成了3個(gè)siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞,48h后收集細(xì)胞,采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測Cr-1基因mRNA水平。結(jié)果顯示,這3個(gè)siRNA均能明顯抑制Cr-1mRNA水平,以S1效果最好,而空載對照組和錯(cuò)配對照組Cr-1mRNA水平無明顯變化(P>0.05)(見圖1)。

        圖1 Cr-1siRNA轉(zhuǎn)染對結(jié)直腸癌細(xì)胞錨著不依賴性增殖的影響

        2.2 siRNA敲除對結(jié)直腸癌細(xì)胞Cr-1基因的影響 本研究進(jìn)一步采用S1siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞,分別采用實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測Cr-1基因mRNA和蛋白水平。結(jié)果顯示,與對照組細(xì)胞比較,siRNA組Cr-1mRNA和蛋白水平明顯降低(P<0.05,見圖2、圖3)。

        圖2 siRNA對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞Cr-1mRNA水平的影響

        圖3 siRNA對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞Cr-1蛋白水平的影響

        2.3 Cr-1siRNA轉(zhuǎn)染對結(jié)直腸癌細(xì)胞軟瓊脂集落形成的影響 軟瓊脂集落形成試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)Cr-1siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞集落生長呈劑量依賴性減少(P<0.05,見圖4)。

        圖4 Cr-1siRNA轉(zhuǎn)染對結(jié)直腸癌細(xì)胞錨著不依賴性增殖的影響

        2.4 Cr-1siRNA轉(zhuǎn)染對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲的影響 采用Boyden小室模型檢測癌細(xì)胞侵襲情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組比較,siRNA組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯下降,且與濃度相關(guān)(P<0.05,見圖5)。

        圖5 Cr-1siRNA轉(zhuǎn)染對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞體外侵襲的影響

        3 討 論

        在基因研究領(lǐng)域中,RNAi和siRNA已引起了廣泛的注意。RNAi是近年來發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)mRNA的生物學(xué)現(xiàn)象,能夠使基因的mRNA被相應(yīng)的雙鏈RNA分子敲除,其效果要遠(yuǎn)強(qiáng)于正義和反義RNA[11]。RNAi最主要的功能在于可以調(diào)節(jié)和關(guān)閉基因的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的各種高級生命活動(dòng)。而siRNA是指RNAi過程中在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的長約21~25核苷酸(nt)的小雙鏈RNA分子,是RNAi作用機(jī)制的重要中間效應(yīng)分子。而且已有人工合成的siRNA,具有明顯的敲除相應(yīng)基因mRNA的效果[10,12~14]。由于siRNA 具有高效敲除基因表達(dá)的工具,已被廣大科學(xué)工作者用來研究基因功能和基因治療的工具。

        為了解Cr-1基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲中的作用,本研究根據(jù)Cr-1基因mRNA特點(diǎn),設(shè)計(jì)siRNA序列,并用化學(xué)方法合成,轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞后,分別采用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR和wetern blot方法檢測Cr-1基因mRNA和蛋白水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Cr-1基因mRNA和蛋白水平明顯下降,提示Cr-1siRNA轉(zhuǎn)染成功。說明該siRNA可作為研究Cr-1基因功能的有力工具。

        接著,我們在體外觀察了Cr-1基因siRNA轉(zhuǎn)染對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞侵襲的影響。正常真核細(xì)胞,除成熟血細(xì)胞外,大多須粘附于特定的細(xì)胞外基質(zhì)上才能抑制凋亡而存活,稱為錨著依賴性(anchorage dependence)。腫瘤細(xì)胞可以錨著不依賴性狀態(tài)生長。腫瘤細(xì)胞在軟瓊脂形成集落的多少與惡性程度呈正相關(guān)。癌細(xì)胞侵襲能力強(qiáng),則在軟瓊脂上形成的集落數(shù)目多。軟瓊脂集落培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)Cr-1siRNA轉(zhuǎn)染處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞軟瓊脂集落數(shù)和穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少,且呈濃度依賴性(P<0.05)。

        Boyden小室模型或Transwell是檢測癌細(xì)胞侵襲試驗(yàn)的經(jīng)典模型,已被廣泛應(yīng)用于探討癌細(xì)胞侵襲的相關(guān)研究中。本研究將經(jīng)Cr-1siRNA轉(zhuǎn)染處理的結(jié)直腸癌549細(xì)胞置于Boyden小室模型中,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染組結(jié)直腸癌細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少,且呈濃度依賴性(P<0.05)。提示Cr-1下調(diào)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的體內(nèi)外侵襲能力。

        本研究提示,Cr-1基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲中起著重要的作用,以siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)可明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力,其內(nèi)在機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

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