景鵬宇，梁智星，梁法禹

活性同種瓣膜是心臟瓣膜置換較理想的材料［1，2］，其制備保存方法對瓣膜組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞活性影響較大。在常規(guī)制取過程中，由于溫度、壓力等因素驟變，會導(dǎo)致瓣膜各層結(jié)構(gòu)之間產(chǎn)生相互的內(nèi)應(yīng)力［3］，從而損傷瓣膜細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M在體環(huán)境，就動脈血流在同種瓣的制備保存中的作用進(jìn)行初步探討，期望為改進(jìn)其質(zhì)量提供新方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 供體為1個月～1.5個月齡的中國白兔36只，雌雄不拘，體重（0.3±0.1）kg；受體為成年中國白兔12只，體重（3.0±0.5）kg，由山西醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。

1.2 移植物準(zhǔn)備及分組1.2.1 滅菌培養(yǎng)液配置 RPMI1640營養(yǎng)液＋頭孢呋辛鈉50 μg／mL＋二性霉素B 2.5μg／mL（pH 值為7.2，滲透壓為226 mOsm／kg）。

1.2.2 凍存液配置 RM11640培養(yǎng)液：10%小牛血清：二甲基亞砜（DMSO）為8∶1∶1，－20℃凍存［4］。

1.2.3 帶瓣主動脈取材 供體兔腹腔注射戊巴比妥鈉（40.0 mg／kg）麻醉，按常規(guī)動物實(shí)驗(yàn)方法暴露心臟，于主動脈弓分支前剪斷。剝離帶瓣主動脈，去除壁上結(jié)締組織及脂肪組織。于主動脈瓣根部下緣保留約5mm的心肌纖維和心內(nèi)膜，同時保留二尖瓣大瓣，將其修剪成瓣下主動脈壁的一部分。血管長1.2 cm～1.5cm，并縫扎兩冠狀動脈開口。

1.2.4 帶瓣主動脈的滅菌培養(yǎng) 將修剪后的帶瓣血管放入滅菌培養(yǎng)液中，在37℃ 含5%CO2的培養(yǎng)箱中滅菌12h。

1.2.5 分組 將以上標(biāo)本隨機(jī)分為A組、B組、C組。A組作為對照組，深低溫液氮保存；B組、C組作為實(shí)驗(yàn)組，頸動脈移植后深低溫液氮保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)組處理

1.3.1 同種帶瓣主動脈移植 受體兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1mL／kg）麻醉，游離雙側(cè)頸動脈。將一側(cè)頸動脈兩端上動脈夾（間隔1.2cm～1.5cm），中間剪斷。采用二定點(diǎn)法等弧度移植帶瓣血管于受體頸動脈。吻合完畢后，讓血管充盈排氣。以同樣的方法移植下一標(biāo)本到對側(cè)頸動脈。每側(cè)吻合限時30min［5］。

1.3.2 術(shù)后管理 清醒后正常飲食，頸部切口不包扎每日消毒3次，給予阿司匹林腸溶片（25mg／d）。術(shù)后不使用抗生素。

1.3.3 移植成功標(biāo)準(zhǔn) 術(shù)后48h受體存活且頸動脈通暢、搏動良好。

1.3.4 取瓣膜標(biāo)本 6只受體兔于術(shù)后48h，將植入的帶瓣血管12份取出，作為B組。另6只于術(shù)后72h取出12份帶瓣血管作為C組。

1.4 深低溫保存 分別放入凍存液中4℃ 滲透平衡15min。使用程控降溫儀以－1℃／min降溫至－80℃ 保存12h，置入液氮罐中保存1個月，復(fù)溫時直接40℃水浴，至解凍后取出主動脈瓣膜。

1.5 細(xì)菌學(xué)檢查 滅菌后、從頸動脈取出后以及解凍后取樣，做細(xì)菌培養(yǎng)，37℃、72h無細(xì)菌生長為陰性。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 HE染色及光鏡觀察 主動脈瓣膜用甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后5μm切片，行蘇木精、伊紅（HE）染色，用Olympus光學(xué)顯微鏡觀察。

1.6.2 細(xì)胞活性檢測 采用FDA（二乙酸熒光素）／PI（碘化丙啶）雙染、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞活率。輕刮去上皮細(xì)胞，剪碎后放入裝有10mL膠原酶Ⅱ（200μg／mL）的燒杯內(nèi)，37℃ 水浴2 h，磷酸鹽緩沖液洗滌，1 800r／min離心，取沉淀行FDA／PI雙染色，300目尼龍網(wǎng)過濾，3min～5min內(nèi)將細(xì)胞懸液通過流式細(xì)胞儀（488nm、200mV）計(jì)數(shù)。每份標(biāo)本計(jì)數(shù)10 000個細(xì)胞，記錄每個標(biāo)本有活性細(xì)胞的百分比。

2 結(jié) 果

2.1 肉眼所見 B、C兩組各發(fā)現(xiàn)1只白兔頸部切口感染，解剖后均發(fā)現(xiàn)瓣葉表面有血栓及贅生物附著。3組標(biāo)本解凍后均呈蒼白色，未見明顯的瓣膜斷裂、鈣化等損傷，3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 光鏡觀察 3組標(biāo)本纖維質(zhì)層的膠原及彈性纖維清晰可見，室面層內(nèi)膜面可見到不連續(xù)內(nèi)皮細(xì)胞存在。低倍鏡下B、C組一個視野內(nèi)均見不到纖維質(zhì)層的膠原及彈性纖維的回折（互成銳角可認(rèn)為是回折）。A組在一個視野內(nèi)可見到纖維質(zhì)層的膠原及彈性纖維的回折數(shù)目為3個，其纖維質(zhì)層總體皺縮程度較B組、C組大。3組室面層皺縮程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 細(xì)胞活性（見表1） B組、C組均有1只兔出現(xiàn)切口感染，均未計(jì)入。

表1 3組細(xì)胞活率比較（±s） %

表1 3組細(xì)胞活率比較（±s） %

組別 n 細(xì)胞活率A組（0h）12 89.75±0.55 B組（48h） 11 90.68±0.371）C組（72h） 11 90.77±0.551）與A組比較，1）P＜0.05

3 討 論

目前，臨床使用的同種瓣膜多采用含抗生素的培養(yǎng)液滅菌、戊二醛／二甲基亞砜冷凍保護(hù)液處理，液氮深低溫保存。臨床應(yīng)用顯示了良好的近中期效果，其壽命在15年～20年［3］，但長期耐久性還有待提高。因此，如何改進(jìn)同種瓣的制備保存方法，提高其保存質(zhì)量，成為活性同種瓣移植基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。

瓣葉的基本組織結(jié)構(gòu)分為三層：從內(nèi)向外依次為有大量內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋的心室面層，由疏松排列的膠原纖維、成纖維細(xì)胞和富含蛋白多糖的細(xì)胞外基質(zhì)組成的海綿層，由成纖維細(xì)胞、其他類型的結(jié)締組織和致密的膠原纖維束組成的纖維質(zhì)層［6］。近年研究發(fā)現(xiàn)，在瓣膜制備保存中，即使是在零壓力下固定，瓣葉的纖維質(zhì)層和室面層之間仍存在相互對抗的內(nèi)應(yīng)力，室面層處于張力狀態(tài)，伸展性較小，而纖維質(zhì)層處于皺縮狀態(tài)，具有良好的伸展性，這種殘余應(yīng)力會損傷瓣膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)［3］。本實(shí)驗(yàn)顯示動脈血流可使同種瓣纖維質(zhì)層舒展，以減小纖維質(zhì)層和室面層之間相互對抗的內(nèi)應(yīng)力對細(xì)胞的損傷，提高同種瓣細(xì)胞活率，對于瓣膜移植后的耐久性有更好的預(yù)期。

然而，在本實(shí)驗(yàn)中尚未進(jìn)一步控制頸動脈血流速度、壓力大小等因素，這將是下一步研究的方向。我們可以體外模擬頸動脈血流循環(huán)，更好地控制壓力、溫度、血壓飽和度等相關(guān)因素，來處理供體瓣膜，更進(jìn)一步方便于臨床瓣膜制備保存，以減小瓣膜結(jié)構(gòu)損傷，提高細(xì)胞活率。

動脈血流可減小瓣膜室面層與纖維質(zhì)層之間的舒縮程度差異，減小瓣膜保存過程中的細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與動脈血流的機(jī)械力作用相關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

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［2］Jin XY，Zhang ZM，Gibson DG，etal.Effects of valve substitute on changes in left ventricular function and hypertrophy after aortic valve replacement［J］.Ann Thorac Surg，1996，62（3）：683－690.

［3］張寶林，徐志云.心臟瓣膜外科學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：230－234.

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