王劍鋒，陳今朝，李江，饒軍

1(東華理工大學(xué)生物系，江西 撫州，344000)

2(長江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶，408100)

根霉胞內(nèi)α-半乳糖苷酶的分離及其酶學(xué)性質(zhì)

王劍鋒1，陳今朝2，李江1，饒軍1

1(東華理工大學(xué)生物系，江西 撫州，344000)

2(長江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶，408100)

根霉Rhizopus sp.A01的菌絲體破碎液依次經(jīng)過三相分離、Sephadex G-100凝膠過濾獲得了電泳純的α-半乳糖苷酶，純化了54.8倍，總酶活回收率達到27.3%，在SDS-PAGE上顯示相對分子質(zhì)量為85.6 ku的單一條帶，凝膠過濾表明該酶表觀相對分子質(zhì)量為302 ku。該酶水解對硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最適pH值為4.5，最適溫度為55℃，表觀Km值為(0.242±0.027)mmol/L，表觀kcat/Km值為4.089×105L/(mol·s);對蜜二糖和棉子糖有弱的水解作用，水解速度依次為138.3μmol/(h·mg)、19.7μmol/(h·mg)。水解活性受Fe2+和Fe3+的顯著激活，但受Mn2+、Cu2+、Hg+和Mg2+等離子的強烈抑制。該酶活性在pH4.0～8.2保持穩(wěn)定，在50℃時保溫90 min，殘余酶活達到了48%。

棉子糖，蜜二糖，α-半乳糖苷酶，三相分離

豆渣是大豆加工的棄余物，含有蛋白質(zhì)19%～22%，木質(zhì)纖維素51%～61%，磷、鉀、鈣、鎂等灰分3%，少量的VB和大豆黃酮苷等[1］營養(yǎng)成分，來源廣泛，是食品和飼料加工的重要原料。但豆渣中同時存在的許多抗?fàn)I養(yǎng)因子卻降低了豆渣的生物可利用度。含有末端α-半乳糖殘基的棉子糖同系物是植物糖類的轉(zhuǎn)運和貯存形式，廣泛分布于植物界，幾乎存在于植物的各個部分[2］;它們在單胃動物消化道中不能被內(nèi)源消化酶消化利用，卻被腸道產(chǎn)氣微生物發(fā)酵利用，致使單胃動物出現(xiàn)腸脹氣、腹泄等癥狀，最終導(dǎo)致食物的消化利用率大幅下降[3］，因而蜜二糖、棉子糖等是一類普遍存在的抗?fàn)I養(yǎng)因子，在大豆中約占7.1%左右[3］。已有研究表明[4］，在食品和飼料中添加或利用 α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，αGAL，EC 3.2.1.22)加工能顯著降低這類抗?fàn)I養(yǎng)因子的不利影響，原因在于αGAL能以外切方式水解非還原端的α-半乳糖苷鍵，而且對多種具有末端α-半乳糖殘基的寡糖、糖脂均有水解活性。許多傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品的制作提示，利用產(chǎn)αGAL的菌株發(fā)酵豆渣也是去除α-半乳糖苷類脹氣因子的有效途徑。基于豆渣固態(tài)發(fā)酵的工藝要求和菌株安全性的考慮，文中利用分離自市售甜酒曲的1株根霉菌Rhizopus sp.A01發(fā)酵豆渣制取α-半乳糖苷酶，結(jié)合三相分離和凝膠過濾對Rhizopus sp.A01產(chǎn)生的胞內(nèi)α-半乳糖苷酶αGAL-R2進行了分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，以期為理解利用根霉去除豆渣中α-半乳糖苷類脹氣因子的機制提供資料，也為食品飼用αGAL的開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

根霉A01(Rhizopus sp.A01)，東華理工大學(xué)生物系實驗室分離自市售甜酒曲。

1.2 根霉A01胞內(nèi)α-半乳糖苷酶的制備與分離

1.2.1 α-半乳糖苷酶的制備

Rhizopus sp.A01孢子接種在豆渣培養(yǎng)基(2%豆渣，pH 6.5)中28℃、100 r/min培養(yǎng)3 d;發(fā)酵醪液經(jīng)絲網(wǎng)過濾收集菌絲體，菌絲體經(jīng)蒸餾水洗滌多次并壓干水分后分散在適量pH 8.0、100 mmol/L Tris-HCl緩沖液中進行超聲破碎，超聲功率800 W、時間20 min、破碎3 s暫停3 s;菌絲破碎液12000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液。

1.2.2 α-半乳糖苷酶的分離

取一定體積冷藏粗酶液，高速離心(12000 r/min，10 min)取上清液;上清液中溶入(NH4)2SO4至15%(w/v)，加入等體積叔丁醇，混勻、靜置10 min，高速離心(12000 r/min，10 min)后去掉中間相;下相中再次溶入(NH4)2SO4至25%(w/v)，與上相的等體積叔丁醇重新混勻、靜置10 min，高速離心(12000 r/min，10 min)后取中間相，并溶解在適量pH 7.5、20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中，即得αGAL-R2酶液;取1.0 mLαGAL-R2酶液進行凝膠過濾(Sepha-dex G-100)，以 pH 7.5、20 mmol/LNaH2PO4-Na2HPO4緩沖液洗脫，流速9.0 mL/h，每3.0 mL收集1管，檢測蛋白峰各管酶活。

1.3 分析方法

1.3.1 蛋白質(zhì)濃度的測定

依據(jù) Bradford 法[5］。

1.3.2 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定及酶純度鑒定[6］

SDS-PAGE條件:濃縮膠4%、分離膠10%，染色劑:Coomassie brilliant blue R-250。

1.3.3 α-半乳糖苷酶活的測定

pNPGal(4-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷)法:5mmoi/L pNPGal溶液 0.2 mL、pH 4.5、100 mmol/L NaAc-HAc緩沖液和適量酶液0.8 mL，設(shè)定溫度下反應(yīng)4 min，2 mL Na2CO3(2%)終止反應(yīng)，以 Na2CO3滅活酶液作對照，400 nm處比色。酶活單位:每1 min產(chǎn)生1μmol對硝基苯所需酶量為1IU。

DNS(3，5-二硝基水楊酸)法:1%蜜二糖(棉子糖)溶液 0.3 mL，pH4.0、100 mmol/L NaAc-HAc緩沖液和適量酶液0.7 mL，一定溫度下準(zhǔn)確反應(yīng)12 h;加入DNS試劑1.0 mL終止反應(yīng)，沸水浴顯色5 min，流水速冷，適當(dāng)稀釋并測定482 nm(反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)波長掃描所得)處光吸收值，以DNS試劑滅活酶液作對照。酶活力單位:每1h產(chǎn)生2μmol(1μmol)葡萄糖還原當(dāng)量所需酶量為1U。

1.3.4 酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性的測定

在不同溫度下以pNPGal法測定酶活，以酶活最高時的反應(yīng)溫度為最適反應(yīng)溫度;酶液在不同溫度下分別保溫20 min、40 min和90 min后測定殘余酶活，以未保溫酶液的酶活為100%，比較不同溫度下酶活的半衰期。

1.3.5 酶的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性的測定

在不同pH的緩沖液中按照pNPGal法測定酶活，以酶活最高時的反應(yīng)pH為最適反應(yīng)pH;將酶液用不同pH的緩沖液同等倍數(shù)稀釋，25℃保溫12h，依pNPGal法測定殘余酶活。

1.3.6 無機離子對酶活的影響

在含5 mmol/L待考察離子的酶促反應(yīng)體系中以pNPGal為底物測定酶活，以去離子水透析的酶液的酶活為100%。

1.3.7 酶促動力學(xué)參數(shù)的測定

酶液在 55℃、pH 4.5、100 mmol/L NaAc-HAc 緩沖液中與不同濃度(0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mmol/L)pNPGal反應(yīng)，測定酶活并用Excel 2007對測定數(shù)值進行非線性擬合，求出酶水解底物的Km、Vmax，測定酶蛋白量計算kcat。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計軟件DPS v3.01專業(yè)版，SSR檢驗顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 根霉A01胞內(nèi)α-半乳糖苷酶的分離與純化

超聲破碎菌絲體細胞后所得粗酶液依次經(jīng)過三相分離和凝膠過濾，αGAL-R2被純化了54.8倍、酶活收率為27.3%(表1)，達到了電泳純(圖1)。凝膠色譜圖上顯示2個蛋白峰，保留時間短的蛋白峰為αGAL-R2活性峰，并且在SDS-PAGE圖譜上顯示單一條帶(圖1)，相對分子質(zhì)量為85.6。依據(jù)相同凝膠色譜條件下蛋白質(zhì)的保留時間與相對分子質(zhì)量的關(guān)系(數(shù)據(jù)未列)推知，αGAL-R2分子是由85.6 ku的亞基構(gòu)成的四聚體，分子質(zhì)量約為302ku。

圖1 α-半乳糖苷酶的凝膠色譜和SDS-PAGE圖譜

表1

2.2 根霉A01胞內(nèi)α-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 pH值對α-半乳糖苷酶活性及穩(wěn)定性的影響

在pH值4.0～6.0的范圍內(nèi)，αGAL-R2對pNPGal均有明顯的水解活性(圖2)，其中pH值為4.5時，酶的水解活性最高;酶活性隨pH變化而下降，pH值由4.0下降至3.0時，相對酶活由78.3%下降到2.1%，而pH值由5.5上升至7.0時，相對酶活由83.6%下降到30%，說明在較低的pH范圍內(nèi)，酶活性對酸度的變化更明顯。在25℃、pH值4.0～8.2的范圍內(nèi)，αGAL-R2的活性近乎完全保留(圖2)，但在pH＜4.0時殘余酶活迅速下降，說明該酶對酸的耐受性差。

圖2 pH對α-半乳糖苷酶活性及穩(wěn)定性的影響

2.2.2 溫度對α-半乳糖苷酶活性及穩(wěn)定性的影響

以pNPGal為底物研究了溫度對αGAL-R2活性和穩(wěn)定性的影響(圖3)。αGAL-R2在30～65℃均有水解活性，30～55℃酶活性隨溫度上升而線性增加至最大值，最適作用溫度為55℃，但反應(yīng)溫度高于60℃時，酶活性急劇下降，65℃時的反應(yīng)活性與30℃時的活性相當(dāng)，只達到最大酶活的32%。αGAL-R2在50℃保溫90 min，酶活保留了48%，而在55℃保溫20 min，酶活僅保留了12%，因此，αGAL-R2在50℃有較好的熱穩(wěn)定性。

圖3 溫度對α-半乳糖苷酶活性和穩(wěn)定性的影響

2.2.3 金屬離子對α-半乳糖苷酶活性的影響

αGAL-R2水解pNPGal的活性受金屬離子的影響(表2)。被試離子(5 mmol/L)中 K+、Zn2+、Ca2+等離子對酶活性無顯著影響;Fe2+和Fe3+對酶活性具有顯著的激活作用，F(xiàn)e2+存在時，相對酶活達到256.8% ±5.9%;但 Mn2+、Cu2+、Hg+和 Mg2+等離子強烈抑制酶活性，而Ba2+的抑制作用較弱。

表2 金屬離子對α-半乳糖苷酶活性的影響

2.2.4 α-半乳糖苷酶的底物特異性及催化效率

在pH 4.5、55℃的反應(yīng)條件下，αGAL-R2水解pNPGal的動力學(xué)常數(shù)分別為:Km=(0.242±0.027)mmol/L，Vmax=(19.344 ± 0.246)IU/mgPr，kcat=(110.39 ±1.404)s-1，kcat/Km=4.089×105L/(mol·s);在pH4.5、40℃時αGAL-R2能水解蜜二糖、棉子糖，水 解 速 度 依 次 為 138.3μmol/(h· mg)、19.7μmol/(h·mg)。因此，αGAL-R2能高效催化pNPGal的水解，而對蜜二糖、棉子糖的水解能力相對較弱。

3 討論

圍繞適用于豆類食品和飼料加工的α-半乳糖苷酶，多種微生物源αGAL得到了研究，它們的酶學(xué)性質(zhì)和分子特性因菌種、菌株不同而有較大差異。一般細菌分泌的αGAL的最適反應(yīng)pH值在5.0～7.5，最適反應(yīng)溫度在 37～40℃[1］，但 Rhodothermus marinus[7］的最適溫度為 85℃;絲狀真菌及酵母分泌的αGAL的最適反應(yīng)pH在4.5～8.0，最適溫度在50～60℃[1］。αGAL 的 pH 穩(wěn) 定 范 圍 多 在 pH5.0～9.0[3，7-9］，熱穩(wěn)定范圍常小于 60℃[1］，也有 Absidia sp.[11］，Penicillium sp.[12］和 Aspergillus terreus GR[10］等菌株達到 65℃，Rhodothermus marinus[7］達到 75℃。產(chǎn)自細菌的αGAL常由同種亞基形成多聚體蛋白[1］如Bifidobacterium bifidum(表觀分子相對質(zhì)量243、亞基85 ku)[13］、Bifidobacterium breve(同二聚體、表觀分子相對質(zhì)量 160)[14］、Rhodothermus marinus(表觀分子相對質(zhì)量 200、亞基 50 ku)[7］，部分真菌源 αGAL也形成多聚體，如源于 Rhizopus sp.、Gibberella sp.(亞基相對分子質(zhì)量 82.0、82.9)[1］。依據(jù) αGAL-R2 的凝膠色譜保留值和SDS-PAGE圖譜推知，αGAL-R2是由相對分子質(zhì)量為85.6的亞基構(gòu)成的四聚體，分子構(gòu)成類似于源于Rhodothermus marinus的αGAL。

αGAL-R2在反應(yīng)溫度 40～60℃、pH 4.0～6.0顯示較高酶活性，最適反應(yīng)溫度為55℃、最適反應(yīng)pH 為4.5，與源于Aspergillus oryzae的 αGAL(pH4.8、50℃)[16］相近。αGAL-R2 在 pH4.0～8.9 的范圍內(nèi)25℃保溫12 h，酶活性近乎完全保留，pH 3.0時酶活幾乎完全喪失;在50℃保溫1h，酶活保留了48%，而55℃保溫20 min時，酶活只保留了12%，由此可知，該酶的熱穩(wěn)定性較差，但該酶的酸熱穩(wěn)定性仍在已有文獻報道的范圍內(nèi)。

αGAL-R2對pNPGal、蜜二糖、棉子糖都能水解，水解pNPGal的能力最強，其Km值與源于Aspergillus terreus GR[10］、Rhizopus sp.F78[1］的 αGAL 近似，但催化效率kcat/Km遠大于前兩者，是一種高比活αGAL。αGAL催化pNPGal水解的活性常受金屬離子的抑制，Cu2+、Fe2+、Mn2+、Hg+等常強烈抑制酶活性，而Na+、K+、Ca2+、Mg2+等 常 對 酶 活 性 抑 制 較弱[1，3，9-10，17］，但是 αGAL-R3 水解的活性卻受 Fe2+、Fe3+的激活，其中Fe2+的激活作用最為顯著，受Mg2+的顯著抑制。許多αGAL對蜜二糖、棉子糖的水解活性很弱，常需要在酶活測定條件下反應(yīng)24h方能檢測到反應(yīng)產(chǎn)物[1］，αGAL-R2水解蜜二糖、棉子糖的活性也較弱，但水解活性較其他來源的αGAL強，反應(yīng)12h即可檢測到反應(yīng)產(chǎn)物，反應(yīng)速度分別為138.3μmol/(h·mg)、19.7μmol/(h·mg)。因此，實驗菌株根霉A01發(fā)酵豆渣能有效去除其中的蜜二糖、棉子糖等物質(zhì)，該菌株在發(fā)酵法消除食品和飼料中的脹氣因子方面具有較大的實際應(yīng)用價值，同時αGAL-R2的高比活性不僅有利于提高該酶的異源表達效率，而且也能為αGAL分子的遺傳改造提供實驗材料。

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ABSTRACTUsing three-phase partitioning followed by filtration chromatography with Sephadex G-100，an intracellular α-galactosidase from Rhizopus sp.A01 grown on soya bean dregs broth was purified to homogeneity with a 54.8-fold increase in specific activity and 27.3%recovery.The relative molecular weight of the enzyme was about 302 ku through gel filtration and 85.6 ku through SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，suggesting that the native enzyme was a tetramer.The α-galactosidase showed high activity against p-nitrophenyl-α-d-galactopyranoside(pNPGal)but had little activity for melibiose and raffinose，and the optimal activity was observed at pH 4.5 and 55℃.The kinetic parameters of Kmand kcat/Kmwere 0.242 ±0.027 mmol/L and 4.089×105L/(mol·s)with pNPGal，and the rates of hydrolysis for melibiose and raffinose were 138.3 μmol/(h·mg)and 19.7 μmol/(h·mg)，respectively.The enzyme activity was significantly activated by Fe2+and Fe3+，but strongly inhibited by Mn2+，Cu2+，Hg+and Mg2+at 5.0 mmol/L.The α-galactosidase was highly stable over pH range from 4.0 to 8.2 at 25℃，and it retained approximately 48%of the original activity after incubation for 90min at 50℃.

Key wordsraffinose，melibiose，α-galactosidase，three-phase partitioning

Purification and Characterization of Intracellular α-galactosidase from Rhizopus sp.A01

Wang Jian-feng1，Chen Jin-zhao2，Li Jiang1，Rao Jun1
1(Department of Biology，East China Institute of Technology，F(xiàn)uzhou 344000，China)
2(College of Life Science and Technology，Yangtze Normal University，Chongqing 408100，China)

碩士，講師。

2011-10-19，改回日期:2012-04-03