藺立杰，趙媛，王建中，王豐俊

(北京林業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程系，北京，100083)

核桃醬油制曲條件的優(yōu)化*

藺立杰，趙媛，王建中，王豐俊

(北京林業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程系，北京，100083)

以核桃粕為蛋白質(zhì)原料，中性蛋白酶活力為指標(biāo)，對制曲工藝進(jìn)行了研究。通過單因素試驗(yàn)分別研究了核桃粕含量、潤水量、蒸料時(shí)間、制曲時(shí)間對成曲蛋白酶活力的影響。并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析，考慮實(shí)際試驗(yàn)條件，得出適宜制曲工藝條件:核桃粕含量55%，潤水量113%，蒸料時(shí)間32 min，制曲時(shí)間32.9 h。在此條件下蛋白酶活力均值為1002.87U/g干基。

核桃粕，響應(yīng)面法，制曲，中性蛋白酶活

醬油是我國傳統(tǒng)的釀造調(diào)味品，營養(yǎng)豐富且風(fēng)味獨(dú)特，含有多種氨基酸、有機(jī)化合物和礦物質(zhì)[1］。目前，釀造醬油是以大豆或者豆粕等植物蛋白為主要原料，以淀粉質(zhì)原料為輔料，經(jīng)米曲霉制曲、發(fā)酵釀制而成[2］。制曲是醬油生產(chǎn)的基礎(chǔ)，制得高品質(zhì)的成曲是生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)醬油的先決條件[3］，成曲的好壞直接影響醬油的品質(zhì)。成曲質(zhì)量可以通過顏色、曲味等感官因素評定，中性蛋白酶是米曲霉生長過程主要分泌的蛋白酶，其活力高低受米曲霉所利用的曲料及生長環(huán)境的影響[4］，可作為成曲質(zhì)量評定的主要理化指標(biāo)。

核桃位居世界四大堅(jiān)果之首[5］，具有很高的食用價(jià)值，資源豐富，是傳統(tǒng)的食品加工原料[6-7］。核桃粕是核桃經(jīng)過物理壓榨提取出大部分油脂后剩下的部分，蛋白含量可達(dá)到40%左右[8］，在核桃蛋白中含有18種氨基酸，有8種必需的氨基酸，其中精氨酸和谷氨酸含量較高[9］，而核桃蛋白制品品種單一，主要有核桃粉、濃縮蛋白、分離蛋白、蛋白肽等[10］。以榨油后的核桃粕為蛋白原料生產(chǎn)核桃醬油，蛋白含量充足且利用率很高[8］。既為核桃的綜合利用提供了廣闊的前景，利于提高核桃粕附加值，又為生產(chǎn)營養(yǎng)醬油提供了方向。本研究采用核桃粕取代傳統(tǒng)的大豆制曲，以中性蛋白酶活力為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對制曲工藝進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳的制曲條件，為進(jìn)一步的研究工作提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料

核桃粕，由河北晶品果業(yè)有限公司提供，油脂含量為32%;麩皮，購于北京本鄉(xiāng)面粉廠。

1.1.2 菌種

滬釀3.042:北京林業(yè)大學(xué)微生物系提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

米曲霉斜面培養(yǎng)基:采用PDA培養(yǎng)基。

種曲培養(yǎng)基[11］:按照 m(麩皮)∶m(豆粕)=4∶1的比例在250 mL三角瓶中加入20 g過10目篩的干料，12 g蒸餾水，拌勻。121℃，0.1 MPa滅菌30 min。

1.1.4 試劑

酪蛋白，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;酪氨酸，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;福林試劑，北京鼎國生物技術(shù)有限公司;其他試劑皆為分析純。

1.1.5 儀器

DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司;LDZX-40AI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;B-260型恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠;752型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司;SW-CJ-1F型潔凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 單因素試驗(yàn)

以成曲中性蛋白酶活力為評價(jià)指標(biāo)，研究核桃粕含量、潤水量、蒸料時(shí)間和制曲時(shí)間對酶活力的影響。

1.2.3 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以核桃粕含量、潤水量、蒸料時(shí)間、制曲時(shí)間為研究對象進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析，對制曲條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3 分析方法

1.3.1 成曲水分的測定

參照ZB/X 66025-1987水分測定法。

1.3.2 蛋白酶活力測定

采用福林法，參照SB/T 10317-1999蛋白酶活力測定法。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 y=97.672x-0.9361，R2=0.9997，酪氨酸濃度在 0～100 μg/mL內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2 制曲條件單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 核桃粕含量對成曲中性蛋白酶活力的影響

潤水量100%，蒸料時(shí)間30 min，制曲時(shí)間32 h時(shí)，核桃粕含量對成曲中性蛋白酶活力的影響見圖2。

圖1 核桃粕含量對成曲中性蛋白酶活力的影響

從圖1可以看出，在核桃粕含量在50%即核桃粕與麩皮質(zhì)量比為1∶1時(shí)，中性蛋白酶活力最佳，增加核桃粕含量，蛋白酶活力下降。原料中的蛋白質(zhì)對米曲霉產(chǎn)生蛋白酶有誘導(dǎo)作用，誘導(dǎo)作用與其含量、種類都有關(guān)系。不同原料營養(yǎng)成分不同，微生物利用原料的難易程度也存在差別[12］，蛋白酶活力隨著質(zhì)量比增加而減小，可能跟核桃粕和麩皮組分含量不同，導(dǎo)致其中營養(yǎng)成分利用難易程度不同有關(guān)。

2.2.2 潤水量對成曲中性蛋白酶活力的影響

核桃粕含量50%，蒸料時(shí)間30 min，制曲時(shí)間32 h時(shí)，潤水量對成曲中性蛋白酶活力的影響見圖3。

圖2 潤水量對成曲中性蛋白酶活力的影響

從圖2看出，隨著潤水量的增加，中性蛋白酶活力逐漸增大，潤水量為120%時(shí)，中性蛋白酶活力達(dá)到最大值。低水分時(shí)，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)溶解性差;但水分過高，會因物料吸水膨脹使得氧氣的傳輸受抑制，供氧效果減弱，影響到米曲霉蛋白酶的分泌，造成酶活力下降。而且水分含量過大，雜菌污染的機(jī)率會相應(yīng)增大[13］。因此，原料的潤水量以120%為宜。

2.2.3 料時(shí)間對成曲中性蛋白酶活力的影響

核桃粕含量50%，潤水量100%，制曲時(shí)間32 h時(shí)，蒸料時(shí)間對成曲中性蛋白酶活力的影響見圖3。

圖3 蒸料時(shí)間對成曲中性蛋白酶活力的影響

從圖3可以看出，隨著蒸料時(shí)間的延長，蛋白酶活力相應(yīng)增大，在30 min時(shí)蛋白酶活力達(dá)到最佳。時(shí)間的繼續(xù)延長，蛋白酶活呈下降趨勢。蒸料處理的目的是使蛋白質(zhì)的次級鍵遭到破壞，露出肽鍵，這種構(gòu)型具有一定的水溶性，對米曲霉具有誘導(dǎo)作用[14］。在30 min之前核桃粕中蛋白質(zhì)變性不足，而在30 min之后蛋白質(zhì)過度變性，此時(shí)蛋白質(zhì)的構(gòu)象都會使米曲霉生長代謝受抑制，蛋白酶活力減小。另外，考慮到能效問題，故蒸料時(shí)間選取30 min。

2.2.4 制曲時(shí)間對成曲中性蛋白酶活力的影響

核桃粕含量50%，潤水量100%，蒸料時(shí)間30 min時(shí)，制曲時(shí)間對成曲中性蛋白酶活力的影響見圖4。

圖4 制曲時(shí)間對成曲中性蛋白酶活力的影響

從圖4可以看出，在制曲時(shí)間32h之前，米曲霉處于生長初期，中性蛋白酶活力呈上升趨勢，隨著時(shí)間的繼續(xù)米曲霉已過生長、成熟的階段，處于生長后期，蛋白酶活力開始下降。因此，制曲時(shí)間以32h為宜。

2.3 制曲條件響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以核桃粕含量(X1)、潤水量(X2)、蒸料時(shí)間(X3)、制曲時(shí)間(X4)作為試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平

2.3.2 回歸方程的建立及檢驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行了29組試驗(yàn)，其中24組析因點(diǎn)，5組中心點(diǎn)，結(jié)果見表2。

將表2的數(shù)據(jù)使用Design-Expert軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析得回歸方程為:

對模型進(jìn)行方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表3方差分析可知，模型 Prob＞F值小于0.01，表明回歸方程是極顯著的。失擬項(xiàng)的Prob＞F值大于0.05，說明所得方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占的比例小，表示所得回歸方程是好的[15］。同時(shí)模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9615，說明該方程能夠很好地反映響應(yīng)值，因此，可以用此模型方程對制曲條件進(jìn)行預(yù)測分析。

2.3.3 因素影響程度分析

通過表3中:F(X1)=103.10，F(xiàn)(X2)=6.92，F(xiàn)(X3)=0.053，F(xiàn)(X4)=0.61，得各因素對制曲條件的影響程度由大到小為:核桃粕含量＞潤水量＞制曲時(shí)間＞蒸料時(shí)間。由顯著性檢驗(yàn)得:試驗(yàn)中 X1X2、X2X3、X3X4對中性蛋白酶活力的影響極顯著，X1X3對中性蛋白酶活力的影響顯著，即核桃粕含量和潤水量的交互作用，潤水量和蒸料時(shí)間的交互作用、蒸料時(shí)間和制曲時(shí)間的交互作用影響極顯著，核桃粕含量和蒸料時(shí)間的交互作用影響顯著，它們之間的交互作用響應(yīng)面圖見圖5～圖8，其他因素間交互作用影響不顯著(未列出)。

表3 回歸方程方差與顯著性分析

圖5 核桃粕含量與潤水量交互影響中性蛋白酶活力的響應(yīng)面圖

圖6 潤水量與蒸料時(shí)間交互影響中性蛋白酶活力的響應(yīng)面圖

從圖5～圖8可看出，核桃粕含量與潤水量對中性蛋白酶活力的交互作用影響最大，潤水量與蒸料時(shí)間交互作用次之，蒸料時(shí)間與制曲時(shí)間交互作用再次，核桃粕含量與蒸料時(shí)間的交互作用影響最小。

圖7 蒸料時(shí)間與制曲時(shí)間交互影響中性蛋白酶活力的響應(yīng)面圖

圖8 核桃粕含量與蒸料時(shí)間交互影響中性蛋白酶活力的響應(yīng)面圖

2.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化及驗(yàn)證

依據(jù)Design Expert軟件進(jìn)行優(yōu)化配置，得到最佳酶活力時(shí)四因素編碼值依次為:X1=0.509，X2=-0.351，X3=0.441，X4=0.223。也就是在核桃粕含量55.09%，潤水量112.98%，蒸料時(shí)間32.205 min，制曲時(shí)間32.892 h時(shí)，得到蛋白酶活力最大預(yù)測值的1014.56 U/g干基?？紤]實(shí)際操作條件，將上述最佳制曲條件修正為核桃粕含量55%，潤水量113%，蒸料時(shí)間32 min，制曲時(shí)間32.9 h，該條件下平行3次測中性蛋白酶活力均值為1002.87 U/g干基，相對誤差為1.15%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對核桃醬油制曲工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到了核桃醬油制曲工藝的二次回歸模型方程，并進(jìn)一步確定了制曲的最佳工藝條件為:核桃粕含量55%，潤水量113%，蒸料時(shí)間32 min，制曲時(shí)間32.9 h。在此工藝條件下，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，所得成曲中性蛋白酶活力均值達(dá)1002.87 U/g干基，相對誤差為1.15%。試驗(yàn)結(jié)果表明采用核桃粕制作醬油曲是可行的，這為后續(xù)制取核桃醬油提供了基礎(chǔ)，拓展了核桃粕的利用途徑。

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ABSTRACTOptimization of Koji-making Technology for Preparing Walnut Soy SauceThe koji-making technology was studied with the activity of neutral protease as index and walnut meal as raw protein material.The single factor experiment was used to investigate the effects of ratio of walnut meal，moisture content，steaming time and koji-making time on the activity of neutral protease.Based on single factor experiments，the koji-making technology was optimized by response surface methodology with four factors and three levels.The results showed the optimum koji-making conditions were as follows:the content of walnut meal was 55%，moisture content was 113%，steaming time was 32 min，time for koji-making was 32.9h.Under such conditions，the activity of proteases reached1002.87 U/g.

Key wordswalnut meal，response surface method，koji-making，the activity of neutral protease

Optimization of Koji-making Technology for Preparing Walnut Soy Sauce

Lin Li-jie，Zhao Yuan，Wang Jian-zhong，Wang Feng-jun
(Department of Food Science and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China)

碩士(王豐俊副教授為通訊作者)。

*國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)資助項(xiàng)目(20100400706)

2012-01-11，改回日期:2012-03-26