顧艷潔，趙偉，楊瑞金，閆文

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無 錫，214122)

2(江南大學(xué)食品科學(xué)與工程國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

高壓脈沖電場作用下亞致死酵母的存在與檢測*

顧艷潔1，趙偉2，楊瑞金2，閆文1

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無 錫，214122)

2(江南大學(xué)食品科學(xué)與工程國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

為探究高壓脈沖電場(PEF)對釀酒酵母的滅菌機理，研究了從亞細胞水平揭示PEF處理下的損傷亞致死酵母細胞的存在及產(chǎn)生規(guī)律。采用pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)模擬體系，30 kV/cm電場強度下循環(huán)處理100～500 μs，通過選擇性培養(yǎng)基與非選擇性培養(yǎng)基菌落計數(shù)對PEF處理前后亞致死酵母細胞進行了研究。結(jié)果顯示，亞致死酵母的臨界滲透壓為4%NaCl，PEF處理后，釀酒酵母的亞致死率可達到4.5個對數(shù)，亞致死細胞數(shù)量達到1.5個對數(shù)，且亞致死程度隨處理時間的延長而加大。選擇性培養(yǎng)基可用于PEF處理過程中亞致死細胞的定量檢測。

高壓脈沖電場(PEF)，釀酒酵母，亞致死細胞，選擇性培養(yǎng)基

高壓脈沖電場殺菌(PEF)是一種很有工業(yè)化前景的非熱殺菌技術(shù)，以其良好的殺菌效果和最大限度保持食品營養(yǎng)成分的特點而備受矚目。PEF的殺菌機理是學(xué)者們的研究熱點，目前人們就PEF對微生物的殺菌效果已有了較深入的研究，但只局限于PEF致死微生物。研究結(jié)果表明，PEF處理對微生物的營養(yǎng)體細胞均有較好的殺滅作用[1］。PEF的殺菌作用與其對微生物細胞膜的影響密切相關(guān)。當(dāng)微生物被置于高壓脈沖電場中時，細胞膜會被破壞，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)容物滲出，引起細胞死亡[2-3］。最近研究結(jié)果表明，PEF除殺死一部分微生物外，還會形成一定比例的損傷亞致死細胞[4-5］，亞致死微生物可在適宜的環(huán)境下修復(fù)，恢復(fù)其繁殖能力，對食品安全及PEF處理食品的貨架期造成很大影響。Christine證實了亞致死微生物的存在[6］，Somolinos等人[7］研究了釀酒酵母經(jīng)PEF處理后亞致死損傷細胞的修復(fù)等問題，證明PEF處理后釀酒酵母產(chǎn)生一定程度的亞致死損傷，其修復(fù)程度取決于處理介質(zhì)的pH和儲存介質(zhì)的性質(zhì)。

釀酒酵母(S.cerevisiae)是液體食品中的常見污染菌種，并會因為酒精發(fā)酵和CO2氣體的產(chǎn)出而引起飲料的腐敗，同時它也是基礎(chǔ)生物學(xué)研究和食品工業(yè)中廣泛存在的菌種，是良好的研究模型。本文應(yīng)用PEF處理釀酒酵母細胞，通過選擇性培養(yǎng)基與非選擇性培養(yǎng)基菌落計數(shù)來驗證亞致死細胞的存在，確定了亞致死酵母細胞的臨界滲透壓，并對亞致死細胞的數(shù)量進行了統(tǒng)計，分析PEF處理對亞致死酵母的產(chǎn)生規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

釀酒酵母菌，江南大學(xué)食品酶學(xué)實驗室提供，菌種編號C-03。

OSU-4L型實驗室規(guī)模PEF連續(xù)處理設(shè)備，俄亥俄州州立大學(xué)，美國;XSW-CJ-2A標準型凈化工作臺，吳江市綠葉空調(diào)凈化有限公司;CT14D型臺式高速離心機，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司;DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司;LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;QYC2102-C型恒溫培養(yǎng)搖床，上海新苗醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物培養(yǎng)與接種

本實驗采用釀酒酵母作為目標菌種，由酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)瓊脂斜面培養(yǎng)基移至YPD液體培養(yǎng)基，30℃下?lián)u床200 r/min培養(yǎng)16 h至對數(shù)生長期，菌體濃度達到108～109CFU/mL。將上述培養(yǎng)液于8000 r/min離心6 min，然后用電導(dǎo)率約為2000 μs/cm，pH7.2的PBS緩沖液重懸，使菌體濃度達到106～107CFU/mL。

1.2.2 高壓脈沖電場殺菌設(shè)備

采用實驗室規(guī)模連續(xù)PEF處理設(shè)備(OSU-4L，美國俄亥俄州立大學(xué))進行，脈沖電場為雙極方形波脈沖電場，管路清洗采用4%NaOH、10%市售次氯酸消毒液和無菌水進行。

1.2.3 高壓脈沖電場殺菌參數(shù)的選擇

實驗選擇6個連續(xù)處理腔，選擇電場強度為30 kV/cm，總處理時間為100、200、300、400、500 μs(處理時間采用循環(huán)方式)，脈沖寬度2 μs，脈沖頻率200 Hz;循環(huán)式冷卻水浴的溫度設(shè)定為15℃。

電場強度E和總處理時間t計算方法如下:

式中，U為電壓，kV;d為電極間距，0.29 cm;Np為單個處理腔內(nèi)接收的脈沖數(shù);Nc為處理腔個數(shù)，6;Wp為脈沖寬度，s;Tr為停留時間，s;f為脈沖頻率，Hz;V為單個腔體積，0.012 cm3;F為物料流速，mL/s。

1.2.4 PEF處理對釀酒酵母菌致死率的影響

根據(jù)GB/T4789.2-2003方法，對PEF處理前后的樣品進行菌落平板計數(shù)。殺菌效果采用致死率來表示，致死率計算公式:

式中，N為PEF處理后的微生物數(shù)，CFU/mL;N0為PEF處理前的微生物數(shù)，CFU/mL。

培養(yǎng)基選用YPD固體培養(yǎng)基，NaCl的濃度為0%，即非選擇性培養(yǎng)基，30℃下培養(yǎng)24 h后計數(shù)。

1.2.5 PEF處理對釀酒酵母菌亞致死率的影響

之前的研究中已經(jīng)有通過非選擇性和選擇性瓊脂培養(yǎng)基對非熱殺菌處理后的微生物進行計數(shù)對微生物的損傷程度進行評估的實驗[8］。Perni等[9］通過向培養(yǎng)基中加入2種不同濃度的NaCl對PEF作用下大腸桿菌和鼠傷寒桿菌分別進行培養(yǎng)，找到了兩種菌的臨界滲透壓并對亞致死細胞數(shù)量進行了檢測，Hyun-Gyun Yuk等[10］采用同樣的方法研究了超高壓CO2對于蘋果酒中乳酸桿菌的亞致死損傷效果。向培養(yǎng)基中添加一定濃度的NaCl形成適當(dāng)滲透壓對非熱處理后的微生物進行培養(yǎng)計數(shù)已成為亞致死微生物檢測的一種有效手段。

本文通過向YPD固體培養(yǎng)基中添加不同濃度的NaCl作為選擇性培養(yǎng)基對PEF處理前后酵母細胞進行培養(yǎng)以找到亞致死酵母的臨界滲透壓，NaCl的濃度梯度選擇2%、3%、4%、5%，30℃下培養(yǎng)48 h后計數(shù)。亞致死率計算公式:

式中，N’:PEF處理后的選擇性培養(yǎng)基中微生物數(shù)，CFU/mL;N0:PEF處理前的微生物數(shù)，CFU/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEF不同處理時間對釀酒酵母的致死率影響

圖1為PEF不同處理時間對PBS緩沖液體系中釀酒酵母致死率的影響。釀酒酵母的致死率是處理時間的函數(shù)，隨著處理時間的增加而愈加顯著，當(dāng)處理時間由100 μs上升至500 μs，電場強度為30 kV/cm時，PBS緩沖體系中的釀酒酵母菌落數(shù)下降了3.3個數(shù)量級。

圖1 不同處理時間對釀酒酵母細胞致死率的影響

在特定的環(huán)境條件下，數(shù)學(xué)模型已成為描述和預(yù)測食源性微生物的生長、存活以及滅活反應(yīng)的重要工具[11］。由圖1可知，PEF對釀酒酵母的致死作用較好地符合一級動力學(xué)模型(R2＞0.97)，30 kV/cm場強作用下PEF對釀酒酵母的殺菌動力學(xué)常數(shù)K為6.3×10-3(1/μs)。這與Marsellés-Fontanet等[11］研究的酵母細胞在橘汁中的殺滅動力學(xué)結(jié)果較為接近。

2.2 PEF不同處理時間對釀酒酵母的亞致死率影響

本實驗選用的幾種NaCl濃度下釀酒酵母的亞致死率隨處理時間的變化趨勢與致死率基本一致，且各個時間點處PEF對于酵母細胞的亞致死率均高于致死率，證明PEF處理后有亞致死酵母細胞的存在。當(dāng)NaCl濃度達到4%時，30 kV/cm場強作用下PEF對釀酒酵母的亞致死殺菌動力學(xué)常數(shù)為8.2×10-3(1/μs)，較其他兩組相比顯著高于未添加NaCl組的致死殺菌動力學(xué)常數(shù)6.3×10-3(1/μs)。NaCl濃度為5%時，平板中菌落數(shù)過小無法計數(shù)，即4%NaCl濃度為釀酒酵母細胞的臨界滲透壓，綜合考慮可采用4%NaCl濃度的選擇性培養(yǎng)基進行PEF處理后亞致死釀酒酵母亞致死細胞數(shù)量的監(jiān)測。

圖2 PEF在不同NaCl濃度下對釀酒酵母的亞致死殺菌動力學(xué)

由添加NaCl濃度為4%的選擇性培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)48 h后菌落計數(shù)情況可知，當(dāng)處理時間達到500 μs時，酵母的亞致死率達到了4.5個數(shù)量級，此時PEF對釀酒酵母的亞致死作用也較好的符合一級動力學(xué)模型(R2＞0.97)。不同時間強度的PEF處理條件下均有亞致死細胞產(chǎn)生，并且亞致死細胞產(chǎn)生數(shù)量與PEF處理強度正相關(guān)。

2.3 PEF不同處理時間對釀酒酵母的亞致死量影響

亞致死細胞的數(shù)量在一定程度上可以通過選擇性培養(yǎng)基與非選擇性培養(yǎng)基計數(shù)的差值估算。亞致死細胞只有在低NaCl濃度下才能修復(fù)，其數(shù)量增加的速度遠大于總修復(fù)量[9］。經(jīng)過同一場強下不同時間PEF處理后，樣品酵母細胞中的亞致死細胞數(shù)量呈現(xiàn)遞增趨勢(圖3)，釀酒酵母經(jīng)PEF處理后產(chǎn)生了1個對數(shù)的亞致死細胞，當(dāng)處理時間達到500 μs時，酵母亞致死細胞的數(shù)量達到了1.5個對數(shù)，證明PEF對酵母細胞的傷害是經(jīng)過一定程度的積累造成的，且酵母細胞損傷的程度大于其修復(fù)的程度。

圖3 不同處理時間對釀酒酵母細胞亞致死細胞數(shù)量的影響

PEF對微生物的作用機制目前尚不完全清楚，關(guān)于脈沖電場殺菌機理的解釋，人們提出了多種學(xué)說，其中以“細胞膜的電穿孔”和“細胞膜的電崩潰”這兩種模型被廣泛接受。其中“電穿孔”模型即細胞膜是脈沖電場作用的關(guān)鍵位點，瞬間高壓脈沖電場可作用于細胞膜脂質(zhì)雙分子層，在細胞膜上形成小孔使細胞膜通透性增強，胞內(nèi)物質(zhì)外溢導(dǎo)致細胞死亡[2-3］。García等[13］和Perni等[9］報道，PEF對大腸桿菌和沙門氏菌的致死作用是由于PEF對微生物細胞的損傷積累所致。PEF處理后會產(chǎn)生亞致死微生物已被證實，目前對于亞致死細胞的檢測主要有兩種手段，其一是通過流式細胞儀結(jié)合熒光染色技術(shù)對亞致死細胞數(shù)量進行實時監(jiān)測[14］，其二就是本文中用到的通過找到亞致死細胞的臨界滲透壓進行選擇性培養(yǎng)以確定其產(chǎn)生數(shù)量。亞致死微生物在適當(dāng)環(huán)境下可自行修復(fù)，會對食品安全及貨架期產(chǎn)生威脅，其進一步滅菌是提高PEF殺菌效果、延長PEF非熱殺菌產(chǎn)品貨架期的重要手段。

3 結(jié)論

(1)經(jīng)過對釀酒酵母亞致死細胞不同滲透壓條件下培養(yǎng)后確定其臨界滲透壓條件為4%NaCl。

(2)經(jīng)30 kV/cm場強下循環(huán)處理500 μs后，酵母細胞的致死量可達到3.3個對數(shù)，亞致死量可達4.5個對數(shù)，PEF對釀酒酵母致死作用及亞致死作用的殺菌動力學(xué)常數(shù)均較好的符合一級動力學(xué)模型，一定處理強度下可產(chǎn)生1.5個對數(shù)的亞致死酵母細胞。

(3)亞致死細胞數(shù)量隨著處理時間的延長而增加，PEF對酵母細胞的致死作用是經(jīng)過逐漸的損傷積累造成的。

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ABSTRACTTo explore the sterilization mechanism of Saccharomyces cerevisiae caused by pulsed electric field(PEF)，the existence and production patterns of sub-lethal yeast cells under PEF treatment were revealed.Using phosphate buffer(PBS)at pH7.2 as model system，S.cerevisiae cells were processed under 30kV/cm electric field strength from 100μs to 500μs.Sub-lethal S.cerevisiae cells were counted respectively after incubation in selective medium and non-selective medium.The results showed that the critical osmotic pressure of sub-lethal S.cerevisiae were 4%NaCl.After PEF treatment，S.cerevisiae became to be sub-lethal with reductions to 4.5 Log units，and the number of sub-lethal cell were 1.5 Log，and the degree of sub-lethal increased with the treatment time increased.Selective medium can be used in quantitative detection of sub-lethal cells during PEF treatment.

Key wordspulsed electric field(PEF)，Saccharomyces cerevisiae，sub-lethal cells，selective medium

Existence and Detection of Sub-lethal S.cerevisiae Cells Under Pulsed Electric Field Treatment

Gu Yan-jie1，Zhao Wei2，Yang Rui-jin2，Yan Wen1
1(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
2(State Key Laboratory of Food Science＆Technology and School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

碩士研究生(楊瑞金教授為通訊作者，E-mail:yrj@jiangnan.edu.cn)。

*國家自然科學(xué)基金(31000829);國家“十二五”863計劃項目(2011AA100801-02);江蘇省自然科學(xué)基金(BK2010148)

2012-03-27，改回日期:2012-05-21