王培磊

（臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東臨沂276000）

NaNO3對(duì)兩種杜氏藻生長(zhǎng)及色素積累的影響

王培磊

（臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東臨沂276000）

研究NaNO3對(duì)兩種杜氏藻Dunaliella salina和Dunaliella parva生長(zhǎng)速度、色素積累的影響和NaNO3的吸收規(guī)律。結(jié)果表明，NaNO3濃度為1.5 mmol/L時(shí)，D.salina生長(zhǎng)最快，最高密度76.4×104cell/mL；對(duì)照組為16.3×104cell/mL；低氮有利于D.salina β-胡蘿卜素積累，β-胡蘿卜素最大值105 mg/g出現(xiàn)在0.5 mmol/L NaNO3樣中，對(duì)照組為45 mg/g；較高的NaNO3有利于葉綠素a的合成；藻液pH開始3 d~5 d急劇上升，后在波動(dòng)中下降。對(duì)D.parva來說，NaNO3濃度為2.5 mmol/L時(shí)生長(zhǎng)最快，細(xì)胞最高密度為295×104cell/mL，對(duì)照組為15×104cell/mL；在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，NaNO3濃度越高，β-胡蘿卜素含量越高，β-胡蘿卜素最大值為37.5 mg/g，葉綠素最大值為65 mg/g；建立了兩種杜氏藻對(duì)NaNO3利用的動(dòng)力學(xué)方程。

杜氏藻；硝酸鹽；生長(zhǎng)；β-胡蘿卜素；利用規(guī)律

Abstract:The effects of NaNO3on the growth,pigment accumulation of two Dunaliella species and assimilated patterns of NaNO3by two Dunaliella species were investigated.The optical growth of D.salina was observed in NaNO31.5 mmol/L and the highest cell density was detected to be 76.4×104cell/mL,the control group only had the maximum cell density of 16.3×104cell/mL.Low N content was favorable to accumulation of β-carotene of D.salina.The maximumβ-carotene of 105 mg/g occurred in 0.5 mmol/L NaNO3media and the control group had the minimumβ-carotene of 45 mg/g.The pH values of D.salina media rose up rapidly in the first 3 d-5 d,then declined zigzagly.The optical growth of D.parva occurred in media with NaNO32.5 mmol/L and the maximum celldensitywasfoundto be 295×104cell/mLandthe controlgrouphadthe minimumcelldensityof15×104cell/mL.The maximum β-carotene of 37.5 mg/g of D.parva was observed in media with 2.5 mmol/L NaNO3and the maximum Chl a content of 65 mg/g was detected in the same media.The assimilated equations of NaNO3by two Dunaliella species were set up.

Key words：Dunaliella;nitrate salinity;growth;β-carotene;assimilated equations

鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）是一種雙鞭毛單細(xì)胞綠藻，可耐高鹽度（20~300）。杜氏藻在脅迫條件下可大量積累β-胡蘿卜素，最高可達(dá)干重的14%，為自然界所有生物之首，因此早在1966年，Massyuk就提出可大規(guī)模培養(yǎng)杜氏藻生產(chǎn)β-胡蘿卜素[1]；另外杜氏藻含有的甘油可達(dá)干重的40%，具有生產(chǎn)甘油的潛在前途[2]；杜氏藻還是一種良好的水產(chǎn)動(dòng)物飼料。我國(guó)具有漫長(zhǎng)的海岸線和眾多的內(nèi)陸鹽湖，具有培養(yǎng)杜氏藻生產(chǎn)β-胡蘿卜素得天獨(dú)厚的自然條件。

氮鹽為影響杜氏藻生長(zhǎng)和β-胡蘿卜素積累的主要環(huán)境因子之一[3]。明確杜氏藻對(duì)不同氮鹽的吸收規(guī)律和杜氏藻生長(zhǎng)的二階段對(duì)氮鹽種類和濃度的不同要求對(duì)優(yōu)化杜氏藻培養(yǎng)基，提高生長(zhǎng)速度，促進(jìn)杜氏藻和β-胡蘿卜素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要意義。

1 材料和方法

1.1 藻種

鹽生杜氏藻Dunaliella salina由內(nèi)蒙古蘭太集團(tuán)生物公司提供；巴夫杜氏藻Dunaliella parva由中科院水生所提供。

1.2 培養(yǎng)條件

1）鹵水：飽和鹵水取自內(nèi)蒙古蘭太鹽湖，用蒸餾水稀釋至鹽度120‰。2）營(yíng)養(yǎng)鹽添加：添加KH2PO40.1 mmol/L，檸檬酸鐵 0.01 mmol/L，NaHCO33.0 mmol/L，一次性添加。NaNO3添加量為變量：0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L，其中 0 為對(duì)照。3）溫度：空調(diào)控溫，（25±1）℃。4）光照：日光燈管照明，光強(qiáng) 3200 lx，光/暗周期為16L/8D。5）其它：250mL三角燒瓶，工作體積150mL。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻種接種。接種密度1.2×104cells/mL。每天搖瓶6次。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣，重復(fù)2次。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和測(cè)定方法

1.3.1 細(xì)胞密度

血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定細(xì)胞密度，每天1次。3個(gè)平行樣共計(jì)數(shù)6次，取平均數(shù)。

1.3.2 β-胡蘿卜素含量的測(cè)定[4]

培養(yǎng)至第11天時(shí)，取藻液5 mL，加入1 g NaCl，用90%丙酮充分萃取，取上清液，用90%丙酮定容至50 mL，721分光光度計(jì)測(cè)定在波長(zhǎng)450 nm時(shí)的吸光值OD450。用下式計(jì)算β-胡蘿卜素含量：

β-胡蘿卜素含量=（定容體積×10×OD450）×1000/（2500×取樣體積）

式中：體積單位均為毫升，mL，根據(jù)每升藻液干藻粉質(zhì)量換算成單位mg/g。

1.3.3 葉綠素a含量的測(cè)定[5]

培養(yǎng)至第7天時(shí)，取藻液5mL，加入1gNaCl，用90%丙酮充分萃取，取上清液，用90%丙酮定容至50 mL，用721分光光度計(jì)分別測(cè)定波長(zhǎng)645 nm和663 nm時(shí)的吸光值OD645、OD663。用下式計(jì)算葉綠素a含量：

葉綠素 a含量=（8.02×OD663+20.21×OD645）×定容體積/取樣體積

式中：體積單位均為毫升，mL，根據(jù)每升藻液干藻粉質(zhì)量換算成單位mg/g。

1.3.4 pH

用Orion Model 828型酸度計(jì)測(cè)定，每天1次。

1.3.5 NO3-濃度

每天取藻液5 mL，離心，鋅鉻還原-重氮偶氮法測(cè)定上清液的NO3-濃度[6]。早期藻液NO3-濃度太高，需稀釋200倍~500倍后測(cè)定，由下式計(jì)算NO3-濃度（mmol/L）

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以0.05作為差異顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1 NaNO3對(duì)杜氏藻生長(zhǎng)的影響

NaNO3對(duì)兩種杜氏藻生長(zhǎng)的影響見圖1和圖2。

圖1可見，NaNO3濃度為1.5 mmol/L時(shí)，D.salina有最高細(xì)胞密度 76.4×104cell/mL（第11天），1.0 mmol/L次之。對(duì)照組密度較低，最高密度僅為19.7×104cell/mL，說明氮鹽缺乏對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利。

圖2顯示，D.parva最高密度295×104cell/mL出現(xiàn)在NaNO3濃度為2.5 mmol/L的樣中（第11天），其次為264×104cell/mL（1.0 mmol/L樣品，第9天）。對(duì)照組同樣有極低的細(xì)胞密度。對(duì)比圖1和圖2可見，D.parva密度總體水平比D.salina要高得多。這可能與D.parva細(xì)胞較小有關(guān)（測(cè)定得知，D.salina平均大小為12.5×15 μm，而 D.parva 為 7.4×10 μm）。

2.2 NaNO3對(duì)杜氏藻β-胡蘿卜素積累的影響

NaNO3對(duì)杜氏藻β-胡蘿卜素積累的影響見圖3。

圖3顯示，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，NaNO3濃度越高，D.salina β-胡蘿卜素含量越低；說明較低的氮鹽對(duì)D.salina β-胡蘿卜素積累有利，D.salina β-胡蘿卜素含量最大值105 mg/g出現(xiàn)在0.5 mmol/L NaNO3樣品中，對(duì)照組僅為 45 mg/g（p＜0.05）；而 D.parva 情況恰恰相反，氮鹽濃度越高，D.parva β-胡蘿卜素越高，D.parva β-胡蘿卜素最高含量37.5 mg/g出現(xiàn)在NaNO3濃度最高的2.5 mmol/L 樣中，對(duì)照組僅為 3 mg/g（p＜0.05）。對(duì)比可知，D.salina積累β-胡蘿卜素的能力遠(yuǎn)高于D.parva，所以生產(chǎn)上一般把D.salina作為養(yǎng)殖對(duì)象。

2.3 NaNO3對(duì)葉綠素a合成的影響

NaNO3對(duì)葉綠素a合成的影響見圖4。

圖4表明，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，NaNO3濃度越高，D.salina葉綠素a含量越高，但超過2 mmol/L反而降低，說明過高的氮鹽對(duì)D.salina葉綠素a合成反而不利。葉綠素 a含量最大值為 64mg/g，對(duì)照組僅為 5mg/g（p＜0.05），說明氮鹽是葉綠素a合成必需的；D.parva葉綠素a情況相似，葉綠素a最大值為65 mg/g，對(duì)照組僅為2.5 mg/g（p＜0.05）。

2.4 NaNO3對(duì)藻液pH的影響

NaNO3對(duì)兩種杜氏藻藻液pH的影響見圖5和圖6。

圖5顯示，對(duì)D.salina來說，前3天藻液pH急劇上升，后在波動(dòng)中上升，但速度緩慢。pH最大值9.58出現(xiàn)在1.0 mmol/L NaNO3樣中。對(duì)照組pH總體水平很低。圖6顯示，D.parva的pH變化趨勢(shì)與D.salina相似，但最大值較?。?.2，出現(xiàn)在2.0 mmol/L樣中，第10天）。值得注意的是8 d～9 d pH有一個(gè)明顯的下降，9 d～10 d時(shí)又上升。

2.5 藻液中NaNO3消耗的情況

兩種藻液中NaNO3消耗的情況見圖7和圖8。

圖7可見，對(duì)D.salina，前5天NaNO3消耗較慢，5 d～9 d明顯加快。NaNO3起始濃度越高，消耗時(shí)間越長(zhǎng)。到第12天試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，1.5、2.0、2.5 mmol/L 3組的NaNO3還沒有完全耗盡。而0.5和1.0 mmol/L樣的NaNO3分別在第6天和第8天耗盡。圖8所示的D.parva藻液的情況相似。

對(duì)1.5 mmol/L組D.salina藻液中NO3-的殘留量對(duì)時(shí)間的函數(shù)關(guān)系進(jìn)行回歸分析，可得NaNO3被D.salina吸收的動(dòng)力學(xué)方程：y=-0.1625x+1.3775，R2=0.9568。

式中：x為培養(yǎng)時(shí)間，d；y為藻液中殘存的NO3-濃度，（mmol/L）；R2為可信度。

同理可得NaNO3被D.parva吸收的動(dòng)力學(xué)方程：y=-0.1562x+1.4254，R2=0.9259。

以上二方程可信度R2均不小于0.90，說明所建立的方程較好地反映了NaNO3的吸收規(guī)律。

3 結(jié)論與討論

本研究表明，NaNO3對(duì)兩種杜氏藻生長(zhǎng)均有明顯影響。對(duì)D.salina來說，NaNO31.5 mmol/L時(shí)生長(zhǎng)速度最快；而對(duì)D.parva，NaNO32.5 mmol/L時(shí)生長(zhǎng)最快，兩種杜氏藻無NaNO3對(duì)照組細(xì)胞密度均極低，說明NaNO3是杜氏藻生長(zhǎng)所必需的。NaNO3對(duì)杜氏藻β-胡蘿卜素的合成影響也很大，特別是D.salina，較低濃度的NaNO3有利于β-胡蘿卜素的合成。從藻液中NaNO3的消耗來看，前5天消耗較慢，5 d～9 d NaNO3消耗明顯加快，這很可能是因?yàn)榍?天藻細(xì)胞尚未長(zhǎng)起來，細(xì)胞密度極低，對(duì)NaNO3的消耗極少。

氮、磷鹽種類及其比例、溫度、光照、鹽度、pH等對(duì)杜氏藻生長(zhǎng)都有重要影響[3]。氮在細(xì)胞代謝中是形成氨基酸、嘌呤、嘧啶、卟啉、氨基糖和胺化合物等的基本元素，因而氮是杜氏藻生長(zhǎng)最重要的營(yíng)養(yǎng)元素[4]。有研究認(rèn)為硝酸態(tài)氮是杜氏藻生長(zhǎng)的最佳氮源[5]。關(guān)于杜氏藻生長(zhǎng)的最適NaNO3濃度，各學(xué)者研究結(jié)果不一。有的認(rèn)為1.0 mmol/L較好[3]，有的認(rèn)為5.0 mmol/L較合適[4]。但后來采用較低濃度的氮鹽獲得了很好的生長(zhǎng)效果[5]。我們的研究結(jié)果支持這個(gè)觀點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)表明，NaNO3濃度為1.5 mmol/L時(shí)，D.salina細(xì)胞生長(zhǎng)最快；而NaNO3濃度為0.5 mmol/L時(shí)，D.salina有最高的β-胡蘿卜素含量。而陳晗華[5]、Hejazi等也認(rèn)為杜氏藻生長(zhǎng)的最適條件為N 1.0 mmol/L，P 0.3 mmol/L。

研究者早已發(fā)現(xiàn)，杜氏藻生長(zhǎng)的二階段對(duì)光照、溫度、鹽度、營(yíng)養(yǎng)鹽等環(huán)境因子要求顯著不同[6]。Laws等發(fā)現(xiàn)2.0 mmol/L的氮鹽對(duì)杜氏藻生長(zhǎng)最好，但氮濃度為0時(shí)，單細(xì)胞有最大的β-胡蘿卜素含量[7]。本研究表明，較高的NaNO3有利于D.salina的生長(zhǎng)，而較低的NaNO3有利于D.salina β-胡蘿卜素的積累，這與Giordano,Hirsch等的研究結(jié)果吻合[8-9]。β-胡蘿卜素的作用除光保護(hù)外，還有其它尚未搞清楚的功能。研究者普遍認(rèn)為，三高一低（高光強(qiáng)、高溫度、高鹽度，低營(yíng)養(yǎng)鹽特別是低氮和低磷）有利于β-胡蘿卜素的合成[10-12]。

很明顯，杜氏藻的細(xì)胞生長(zhǎng)和β-胡蘿卜素積累是兩個(gè)矛盾的生理過程，適于細(xì)胞生長(zhǎng)的氮、磷濃度不適合其β-胡蘿卜素積累。對(duì)此，我們可以合理控制氮鹽濃度，既能獲取較大生物量，又能獲得較大的β-胡蘿卜素產(chǎn)量。據(jù)此，Amotz提出了杜氏藻生產(chǎn)的二階段養(yǎng)殖法[11-12]，即先用較低的鹽度和光照及較高的氮鹽條件使藻增殖至較理想的密度，再提高鹽度和光照脅迫β-胡蘿卜素的積累。

培養(yǎng)過程的前6天，藻液pH明顯升高，最高上升到 9.49。隨后 4 d～5 d pH 又有所降低。Fuggi認(rèn)為[13]，培養(yǎng)后期，死細(xì)胞酸敗、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗、代謝產(chǎn)物積累均可導(dǎo)致pH下降，我們的鏡檢結(jié)果支持Fuggi的觀點(diǎn)。

Goldman研究認(rèn)為[14]，杜氏藻細(xì)胞生長(zhǎng)最適pH為8.5，而β-胡蘿卜素積累階段適宜的pH是7.8～8.2。pH上升是限制藻類生長(zhǎng)的一個(gè)重要因子，對(duì)杜氏藻和β-胡蘿卜素生產(chǎn)非常不利。生產(chǎn)上大多采用通入CO2的辦法加以解決，既能調(diào)節(jié)pH，又能補(bǔ)充碳源。

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Effects of NaNO3on Growth and Accumulation of Pigments in Two Kinds of Duanaliella Species

WANG Pei-lei
（Life Department,Linyi University,Linyi 276000,Shandong,China）

2011-12-16

王培磊（1966—），男（漢），教授，博士，研究方向：海洋生物學(xué)。