成建國，張善飛，張 利，趙長新，郭繼強

(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034)

酵母細胞壁多糖分子量分布和結(jié)構(gòu)的初步分析

成建國，張善飛，張 利，趙長新，郭繼強*

(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034)

以啤酒酵母細胞壁多糖為研究對象，比較了Sevage法和三氯乙酸(TCA)法脫蛋白效果，利用凝膠滲透色譜法(GPC)測定了細胞壁多糖的分子量分布，用葡聚糖凝膠G-100對多糖進行了純化，最后用紅外光譜法分析了多糖組分D的結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明:Sevage法脫蛋白效果較好，GPC測定結(jié)果得出酵母細胞壁多糖有5個組分，其重均分子量為1.31745×105、7.0863 ×104、3.6988 ×104、1.8277 ×104、8.342 ×103。紅外光譜分析得出多糖組分 D 在 890.51cm-1和808.48cm-1有特征吸收，為β-D-吡喃型結(jié)構(gòu)，在844cm-1處沒有吸收峰，不含有或含有少量的α-型糖苷鍵。

細胞壁多糖，凝膠滲透色譜法，紅外光譜法

Abstract:Yeast cell wall polysaccharides was used as raw material，the effect of Sevage method and trichloroacetic acid(TCA)method for removing protein were compared.The molecular weight distribution of cell wall polysaccharides was measured by gel permeation chromatography(GPC).Purified polysaccharides with Sephadex G-200，and the structure of cell wall polysaccharides was analyzed by infrared spectroscopy analysis.The results showed that sevage method showed the better deproteinization effect.GPC measured result showed that yeast cell wall polysaccharides had five components，the corresponding average molecular weight(Mw)of the five constituents were 1.31745 ×105、7.0863 ×104、3.6988 ×104、1.8277 ×104、8.342 ×103.The IR spectra showed that the polysaccharide D characteristic was β-D-pyran-type structure which had characteristic absorption in 890.51cm-1and 808.48cm-1，there did not find the absorption peak in the 844cm-1，so not or less of the α-type glycosidic bond.

Key words:cell wall polysaccharides;gel permeation chromatography(GPC);infrared spectroscopy

近年來，由于多糖和多糖的復(fù)合物糖肽具有很好的生物活性，在抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等方面起到了有效的作用，并且微生物多糖具有安全無毒、理化性質(zhì)獨特、來源廣泛等優(yōu)良性質(zhì)［1-4］，因此越來越受到廣大食品、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)家們的關(guān)注。目前對啤酒酵母的綜合利用大多數(shù)集中在蛋白質(zhì)、核酸、維生素、微量元素和酶方面，對其細胞壁多糖的開發(fā)應(yīng)用研究很少，所以對酵母細胞壁多糖的研究很有前景。在酵母細胞壁多糖的研究中對多糖進行純化是很重要的一個環(huán)節(jié)，而且一般提取到的多糖組成也比較復(fù)雜，酵母多糖的生物活性和結(jié)構(gòu)與相對其分子量大小有著密切的聯(lián)系。本文以啤酒酵母為材料，對細胞壁多糖進行了提取純化［5］，利用(GPC)凝膠色譜進行了多糖分子量分布測定［6-9］，并且還利用拉曼紅外光譜法進行了結(jié)構(gòu)分析［10-14］，為今后研究酵母細胞壁多糖的生物活性和結(jié)構(gòu)提供了方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

啤酒酵母 大連工業(yè)大學(xué)菌種保藏中心提供;葡聚糖標準品(Dextran Standard)系列(色譜純)、葡聚糖凝膠G-100、纖維素DEAE-52 Sigma公司;其它試劑 均為分析純。

LABCONCO型低溫冷凍干燥機 美國LABCONCO公司;低速離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;UV-2550型紫外分光光度計 日本島津;Nexus-870型傅里葉變換紅外光譜儀 Nicolet公司;Waters 2695型凝膠滲透色譜系統(tǒng) Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌的培養(yǎng) 將酵母菌從斜面接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中(酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%、pH6.0)500mL三角瓶裝液量150mL培養(yǎng)16h達到對數(shù)生長期，按5%接種量接入YPD培養(yǎng)基中4.5L發(fā)酵罐培養(yǎng)(溶氧 60%、初始 pH6.0、30℃、轉(zhuǎn)速200r/min)，培養(yǎng)48h后收集培養(yǎng)液，4000r/min離心20min取沉淀，沉淀用0.05mol/L的PBS緩沖液反復(fù)洗滌三次得到酵母細胞，菌體進行冷凍干燥，-80℃保藏備用。

1.2.2 酵母細胞壁粗多糖的提取 取干酵母用0.1mol/L的 Tris-HCl緩沖液(0.5mmol/L EDTA、0.5mmol/L DTT)懸浮菌體料液比1∶20，進行超聲波細胞破碎(800W，15min，冰浴)，4000r/min離心20min收集沉淀，用PBS緩沖液反復(fù)洗滌沉淀直到上清液澄清為止，得到酵母細胞壁。然后把細胞壁用0.2mol/L的NaOH稀堿液懸浮，料液比1∶50，沸水浴震蕩提取4h，4000r/min離心20min取上清液得到酵母細胞壁粗多糖進行下一步實驗。

1.2.3 粗多糖脫蛋白 采用文獻［6］的優(yōu)化結(jié)果進行粗多糖中蛋白質(zhì)的脫除(用Sevage萃取三次，4%的TCA鹽析過夜)，最后再用3倍體積無水乙醇進行醇沉過夜，4000r/min離心20min取沉淀用去離子水溶解，然后用3ku分子量的透析袋進行透析24h，冷凍干燥，取凍干的多糖配制成2mg/mL，用紫外分光光度計在180～1100nm范圍內(nèi)進行全波長掃描，通過檢測有無蛋白和核酸特征吸收峰來確定脫蛋白效果。

1.2.4 GPC酵母細胞壁多糖分子量分布測定

1.2.4.1 GPC校正曲線的制作 色譜條件:色譜柱TOSOH 公司 Shodex SUGAR SC1211(6μm，250mm ×6mm)，流動相0.05mol/L NaH2PO4/Na2HPO4緩沖溶液，pH7.0;流速0.5mL/min;柱溫40℃;進樣量20μL。

將相對分子質(zhì)量分別為 5900、11800、22800、47300、112000、212000、404000 的葡聚糖 標 準品Dextran用流動相配成質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的標準樣品液，進樣量為20μL，采集色譜圖。以標準葡聚糖分子量的對數(shù)lgMw為縱坐標，洗脫體積Ev為橫坐標，繪制“l(fā)g Mw-Ev”曲線，用 Breeze GPC系統(tǒng)軟件對曲線進行n次回歸擬合(n=1～5)，得出與曲線相關(guān)度較好的葡聚糖GPC校正曲線方程［6-9］。

1.2.4.2 啤酒酵母細胞壁多糖分子量分布測定 采用1.2.3中脫蛋白方法較好地進行細胞壁多糖的精制，把干燥好的多糖樣品用流動相配制成2.0mg/mL，過0.45μm水系微孔復(fù)合膜，取1mL手動上樣，采集色譜圖。根據(jù)1.2.4.1所得到的葡聚糖校正曲線，利用Breeze GPC系統(tǒng)軟件分析酵母細胞壁多糖的GPC譜圖，計算出多糖各組分的重均分子量Mw和相應(yīng)峰面積。

1.2.5 葡聚糖凝膠G-100純化釀酒酵母細胞壁多糖

葡聚糖凝膠G-100經(jīng)過處理后裝柱到60cm，取脫蛋白后凍干的粗多糖配制成5mg/mL，上樣2mL，以0.2mol/L的 NaCl進行洗脫，控制洗脫速度0.5mL/min，每管收集3mL，用紫外可見分光光度計在220nm處測定吸光值，檢測多糖吸收峰，取吸收峰面積最大的組分D，透析凍干進行純度鑒定。

1.2.6 多糖的DEAE-52柱層析純度鑒定 纖維素凝膠DEAE-52用1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH先后處理4h，然后用去離子水洗至中性，裝柱40cm用去離子水平衡3h，然后取凍干的多糖組分D，用水稀釋到一定濃度上樣，再用0.05～1.0mol/L的NaCl梯度洗脫，流速1mL/min，每管3mL收集洗脫液，紫外分光光度計220nm處檢測結(jié)果。

1.2.7 紅外光譜法分析細胞壁多糖結(jié)構(gòu) 取凍成干粉的酵母細胞壁多糖樣品組分D 50mg，加入1g干燥溴化鉀粉末在瑪瑙研缽中混勻，然后取出壓片，在拉曼紅外光譜儀上進行掃描分析，波長范圍:400～4000cm-1，保存圖譜進行結(jié)構(gòu)分析［10-14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 純化后酵母細胞壁多糖紫外全波長掃描結(jié)果

細胞壁多糖經(jīng)過Sevage法脫除蛋白，透析除去小分子量雜質(zhì)后紫外分光光度計全波長掃描結(jié)果見圖1。

圖1 Sevage法脫蛋白多糖的紫外特征吸收曲線Fig.1 UV absorption curve for Sevage method on deproteinization polysaccharide

細胞壁多糖經(jīng)過TCA法脫除蛋白，透析除去小分子量雜質(zhì)后紫外分光光度計全波長掃描結(jié)果見圖2。

圖2 TCA法脫蛋白多糖的紫外特征吸收曲線Fig.2 UV absorption curve for TCA method on deproteinization polysaccharide

由圖1和圖2可以看出酵母細胞壁多糖在紫外210～220nm處有強的特征吸收，所以我們可以通過檢測在該波長范圍有無特征吸收、吸收強弱來判定樣品有無酵母細胞壁多糖以及多糖含量。由圖1可以看出，利用Sevage法脫除蛋白后的細胞壁多糖樣品在260nm和280nm處沒有明顯的吸收峰，說明樣品中蛋白和核酸類雜質(zhì)去除干凈，多糖純度高。圖2在260nm和280nm處與圖1相比較有明顯的吸收，說明用TCA法蛋白質(zhì)的效果不如Sevage法。綜上得出文獻［6］多糖中蛋白質(zhì)的脫除方法也適用于酵母細胞壁多糖中蛋白、核酸等雜質(zhì)的脫除;此外得出，運用紫外分光光度計在210～220nm處測定吸光度來檢測酵母多糖。

表2 糖類物質(zhì)紅外特征吸收基團［10-12］Table 2 Infrared characteristic absorption of Carbohydrate groups

2.2 GPC校正曲線

用Breeze GPC軟件以標準葡聚糖相對分子質(zhì)量的對數(shù)lgMw對洗脫體積Elution Volume作圖，如圖3所示，并進行回歸處理，得到葡聚糖標準方程:lgMw=-0.0036x3+0.1483x2-2.3688x+18.911(x為洗脫體積)，R2=0.9998具有良好的線性關(guān)系。

圖3 葡聚糖系列標準品回歸曲線Fig.3 Regression curve of a series of dextrans standard substances

2.3 酵母細胞壁多糖分子量分布趨勢

由圖4和表1可以看出酵母細胞壁多糖分子量分布范圍較廣，主要有五個分子量組分其中組分3和組分4重均分子量為分別為3.6988×104和1.8277×104，二者相對含量最多分別為 45.88%和36.143%，組分2分子量為7.0863×104相對含量為13.552%，大分子量組分1和小分子量組分5相對含量較少分別為6.0987%和7.57%。

圖4 啤酒酵母細胞壁多糖GPC分布曲線Fig.4 GPC curve of yeast cell wall polysaccharides

2.4 細胞壁多糖分離純化結(jié)果

圖5為脫蛋白后的啤酒酵母細胞壁多糖經(jīng)過葡聚糖凝膠G-100分離結(jié)果，上圖顯示通過對不同洗脫時間收集液在220nm處測定吸光度得到B、C、D、E四個不同組分的多糖。其中組分D含量最高，組分B、C、E相對含量較少，所以取組分D的洗脫液進行冷凍干燥，進行進一步的純度鑒定。

表1 啤酒酵母細胞壁多糖分子量分布分析結(jié)果Table 1 Molecular weight distribution analysis result of yeast cell wall polysaccharides

圖5 酵母細胞壁多糖的葡聚糖凝膠G-100洗脫曲線Fig.5 Sephadex G-100 elution curve for yeast cell wall polysaccharides

2.5 細胞壁多糖DEAE－52洗脫結(jié)果

圖6顯示對細胞壁多糖組分D經(jīng)過纖維素柱DEAE-52梯度洗脫經(jīng)檢測得到單一峰，說明多糖組分D是經(jīng)過脫蛋白和葡聚糖凝膠純化后可以得到分子量均一的純度很高的多糖樣品。

圖6 DEAE-52洗脫曲線Fig.6 Elution curve of DEAE-52

2.6 啤酒酵母細胞壁多糖組分D紅外圖譜

由表2和圖7分析得出，啤酒酵母細胞壁多糖組分D在3367.46cm-1處有很強的特征吸收峰，為C—H分子內(nèi)或分子間伸縮振動;在2931.25cm-1處有較強的吸收峰，說明多糖中有較多的甲基和亞甲基，也說明了多糖分子鏈較長，分子量很大;在1657.97cm-1處的吸收峰，說明多糖中還處在有大量的酰胺基，多糖組成中可能含有氨基糖;在1700～1400cm-1波段的吸收峰是糖鏈中 C=C、C=O鍵的特征吸收;在1064.47cm-1處的強吸收，說明多糖中存在吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的糖鏈;在指紋區(qū)890.51cm-1和808.48cm-1處的吸收峰，進一步證明糖鏈是 β-D-吡喃結(jié)構(gòu);在844cm-1處沒有吸收強吸收峰，說明糖鏈中α-型糖苷鍵鍵型很少。綜上說明酵母細胞壁多糖組分D中單糖主要以β-型糖苷鍵相連接，可能含有氨基糖。

圖7 啤酒酵母細胞壁多糖紅外圖譜Fig.7 IR spectrum of yeast cell wall polysaccharides

3 結(jié)論

本文對啤酒酵母細胞壁多糖脫蛋白方法進行了比較，利用紫外全波長掃描得出Sevage法脫蛋白比TCA法更徹底，蛋白脫除效果好，更有利于多糖的性質(zhì)分析。GPC測定多糖分子量得出:細胞壁多糖主要有5個組分，其中組分3和組分4含量較多。利用葡聚糖凝膠G-100進行酵母細胞壁多糖的純化得到4個組分，對含量最多的組分D進行純化鑒定為分子量單一的純多糖，通過拉曼紅外光譜初步分析了酵母細胞壁多糖組分D的簡單構(gòu)型，得出多糖D是β-D-吡喃型糖，主要以β-型苷鍵連接，α-型糖苷鍵較少，含有部分氨基糖。

［1］Oci V E，Liu F.Immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide-protein complexes［J］.Currentmedicinal chemistry，2000(7):715-729.

［2］吳小剛.酵母多糖的研究［D］.武漢:湖北工業(yè)大學(xué)，2006.

［3］王義華，徐梅珍，江萍，等.啤酒酵母多糖的提純、化學(xué)組成及抗氧化性質(zhì)鑒定［J］.微生物學(xué)通報，2006，30(4):51-54.

［4］杜昱光，白雪芳，虞星炬，等.寡聚糖類物質(zhì)生理活性的研究［J］.中國生化藥物雜質(zhì)，1997，18(5):268-270.

［5］劉玉潭，梁華，蔡永萍，等.天麻多糖提取純化方法及性質(zhì)的初步研究［J］.激光生物學(xué)報，2007，16(4):495-500.

［6］鄭必勝，何祿英.廣東蟲草多糖脫蛋白及凝膠滲透色譜法表征其分子量分布的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2009，25(6):707-710.

［7］金鑫，賴鳳英.仙人掌多糖的提取、分離純化及GPC法測定其分子量［J］.現(xiàn)代食品科技，2006，22(2):138-140，149.

［8］耿安靜，陳健，徐曉飛.GPC法測定香菇多糖的含量及相對分子質(zhì)量 ［J］.現(xiàn)代食品科技，2009，25(4):458-460.

［9］趙峽，苗輝，范惠紅，等.用GPC法測定硫酸多糖911的分子量和分子量分布［J］.青島海洋大學(xué)學(xué)報，2000，30(4):623-626.

［10］李健，張竹青，陳輝.氣相色譜法和紅外光譜對金針菇多糖的分析研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(9):147-149.

［11］張劍韻，包立軍，梁進，等.桑葉多糖的分離及紅外光譜和氣相色譜法分析［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2007，33(4):549-552.

［12］張聲俊.紅外光譜法對冬蟲夏草的三級鑒定和研究［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，2011，30(3):230-234.

［13］王溪，張益波，查曉清，等.基于小波包變換的云芝蛋白和多糖的近紅外光譜分析［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21(10):2549-2551.

［14］鐵梅，李闖，費金巖，等.富硒金針菇子實體的硒多糖的分離純化技術(shù)及紅外光譜研究［J］.分析測試學(xué)報，2008，27(2):158-161.

Analysis of molecular weight distribution and primary structural of yeast cell wall polysaccharides

CHENG Jian-guo，ZHANG Shan-fei，ZHANG Li，ZHAO Chang-xin，GUO Ji-qiang*
(Biological Engineering Institue，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China)

TS201.2+3

A

1002-0306(2012)12-0143-04

2011-10-26 *通訊聯(lián)系人

成建國(1985-)，在讀碩士研究生，研究方向:微生物代謝衰老機制。