陳 婧，王 斌，李德明，潘 力

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006）

疏棉狀嗜熱絲孢菌耐熱脂肪酶在無孢黑曲霉中的高效表達

陳 婧，王 斌，李德明，潘 力*

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006）

綜合考慮密碼子偏愛性、RNA穩(wěn)定性以及自由能等因素，對疏棉狀嗜熱絲孢菌（Thermomyces lanuginosus）耐熱脂肪酶（tll）基因序列進行密碼子優(yōu)化并全基因合成。將合成的tll基因連接到克隆載體，然后亞克隆到表達載體pHGWPT-tll，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化無孢黑曲霉SH-2。經(jīng)過三丁酸甘油酯平板、SDS-PAGE以及Western Blotting鑒定，成功表達了tll基因。發(fā)酵72h，轉(zhuǎn)化子脂肪酶酶活最高達36U/mL。轉(zhuǎn)化子經(jīng)等離子誘變得到的突變株的脂肪酶比活力比出發(fā)菌株提高約37%。

疏棉狀嗜熱絲孢菌，耐熱脂肪酶，黑曲霉，重組表達

Abstract：We optimized the codon usage of Thermomyces lanuginosus lipase（tll） gene based on codon usage bias，RNA stability and free energy，and synthesized the optimized tll gene.The obtained tll gene was inserted into a clone vector，and then subcloned to the expression vector pHGWPT-tll.The vector pHGWPT-tll was transformed into non-spore Aspergillus niger SH-2 via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation using hygromycin B resistant gene as the selection marker.A.niger transformants bearing the tll gene，were selected by tributyrin hydrolyzing plate.The recombinant protein was verified by SDS-PAGE and Western blotting.After 72h fermentation，the lipase activity of transformants reached 36U/mL.Furthermore，the tll transformants was subjected to mutagenesis via atmospheric and room temperature plasma（ARTP）.The specific activity of the mutants was 37%higher than that of the original transformants，suggesting that tll gene could be highly expressed in A.niger.

Key words：Thermomyces lanuginosus；thermostable lipase；Aspergillus niger；recombinant expression

黑曲霉具有很強的蛋白分泌能力[1]，蛋白產(chǎn)量可達到30g/L以上[2]，是重要的蛋白生產(chǎn)平臺之一[2-4]，被美國FDA認定為安全菌株（GRAS），使其在各領(lǐng)域中受到的關(guān)注與日俱增[5]。隨著根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（Arobacterium tumefaciens mediated transformation，ATMT）在絲狀真菌中的成功應(yīng)用[6-10]，黑曲霉更多被作為轉(zhuǎn)化宿主進行外源基因表達[11]。一般黑曲霉分生孢子頭呈褐黑色、分生孢子梗長短不一（圖1A），本研究使用的無孢黑曲霉為工業(yè)誘變菌，有很強的糖化酶分泌能力，不產(chǎn)孢子、菌落呈乳白色且菌絲短?。▓D1B）。粗短的菌絲易形成小而松散的菌球，有益于代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[12]，因此該菌擁有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。疏棉狀嗜熱絲孢菌（T.lanuginosus）是一種嗜熱真菌，其脂肪酶具有專一性強、選擇性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)點[13]，廣泛應(yīng)用于有機酸合成[14]、食物加工及油的水解等行業(yè)，具有重要的經(jīng)濟價值。Wai Prathumpai等[15]將其在黑曲霉（NW297-14和NW297-24）中表達，以硝基苯基丁酸為底物，酶活達到6U/mL；鄭艷等[16]以畢赤酵母為宿主，以橄欖油為底物，酶活達到7.2U/mL。目前，還沒有將疏棉狀嗜熱絲孢菌耐熱脂肪酶在無孢黑曲霉中表達的報道。本研究使用黑曲霉糖化酶啟動子構(gòu)建表達載體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)tll基因轉(zhuǎn)化至無孢黑曲霉SH-2，然后使用突變率高、突變譜廣、重復(fù)性好[17]的等離子誘變技術(shù)進行誘變，實現(xiàn)tll在無孢黑曲霉中的高效重組表達。

圖1 淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)的黑曲霉MA169.4和無孢黑曲霉SH-2Fig.1 Aspergillus niger MA169.4 and Sporeless Aspergillus niger SH-2 cultured on solid starch medium

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉SH-2 糖化酶生產(chǎn)企業(yè)；根癌農(nóng)桿菌LBA4404 廣東省農(nóng)科院；疏棉狀嗜熱絲孢菌耐熱脂肪酶基因tll（3’端添加His6組氨酸標簽）南京金斯瑞生物科技有限公司合成；雙元表達載體質(zhì)粒pHGW（含潮霉素抗性基因HygBr）比利時植物學(xué)研究中心（VIB）；大腸桿菌Mach1T1、ccdB Survival 本實驗室保藏；潮霉素 美國Merck公司；乙酰丁香酮sigma-aldrich公司；三丁酸甘油酯 百靈威公司；限制性內(nèi)切酶 美國Fermentas公司；PCR引物 Invitrogen合成；LC、IM和MM培養(yǎng)基[9]，淀粉培養(yǎng)基（g/L） 牛肉膏3，蛋白胨10，酵母粉2，淀粉10，NaCl 2，瓊脂粉17，pH5.5；CD培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖20，硝酸鈉3，KCl 0.5，MgSO40.5，K2HPO41、FeSO40.01，瓊脂粉15，pH5.5。

Centrifuge5418型離心機、Mastercycler gradient PCR儀 德國eppendorf公司；?KTA explorer蛋白純化系統(tǒng) 美國GE公司；ARTP生物育種機 北京思清源生物科技公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 耐熱脂肪酶基因表達載體的構(gòu)建 利用引物Sig-forward/Sig-reverse PCR擴增黑曲霉糖化酶基因的信號肽及起始密碼子ATG上游10bp序列（Kozak序列）；利用引物TLL-forward/TLL-reverse PCR擴增經(jīng)密碼子優(yōu)化的tll基因，再利用融合PCR，將上述兩個片段連接成一個DNA片段，命名為Sig-tll。

以黑曲霉基因組DNA為模板，利用引物PglaA-forward/PglaA-reverse擴增黑曲霉糖化酶啟動子（PglaA），利用引物TglaA-forward/TglaA-reverse擴增糖化酶終止子（TglaA），再利用融合PCR，將上述兩個片段連接成一個DNA片段，命名為PT。PT片段經(jīng)連接克隆載體pSIMPLE-18 EcoRV/BAP Vector后，測序驗證正確后用HindIII/XbaI雙酶切亞克隆到農(nóng)桿菌雙元載體pHGW，命名為pHGWPT。

用PvuII酶切質(zhì)粒pHGWPT并去磷酸化處理，將片段Sig-tll經(jīng)磷酸化處理后連接到質(zhì)粒pHGWPT上的啟動子（PglaA）和終止子（TglaA）之間，通過PCR篩選方向性，挑選方向正確的重組子測序驗證，質(zhì)粒命名為pHGWPT-tll。所有引物序列見表1。

1.2.2 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)耐熱脂肪酶表達載體轉(zhuǎn)化無孢黑曲霉SH-2 參照朱錦輝等[18]報道的方法，將構(gòu)建的pHGWPT-tll表達載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，挑選陽性轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒進行鑒定。

參照Caroline B Michielse等[9]報道的轉(zhuǎn)化方法，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)pHGWPT-tll轉(zhuǎn)化無孢黑曲霉SH-2并得到轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子單菌落轉(zhuǎn)接至含0.5%（v∶v）三丁酸甘油酯的CD固體培養(yǎng)基（三丁酸甘油酯平板）上，30℃培養(yǎng)2d，觀察轉(zhuǎn)化子周圍有無水解圈出現(xiàn)，對轉(zhuǎn)化子進行初步鑒定。分別提取宿主菌SH-2和轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，利用引物glaA-forward/glaA-reverse、TLL-forward/TLL-reverse及hygB-forward/hygB-reverse分別擴增黑曲霉糖化酶基因（glaA，約1kb）、耐熱脂肪酶基因（Sig-tll，約1kb）及潮霉素抗性基因（HygBr，約1kb）進行鑒定。

使用2%糖（1%葡萄糖+1%麥芽糖）為碳源的YPD培養(yǎng)基，30℃，250r/min，分別對宿主菌SH-2和轉(zhuǎn)化子發(fā)酵3d。攜帶His6組氨酸標簽的tll蛋白能與親和層析柱牢固結(jié)合而進行有效洗脫，因此將發(fā)酵液離心過濾后使用His-tag親和層析柱純化，純化后轉(zhuǎn)化子的tll蛋白使用考馬斯亮藍法測定濃度；以橄欖油為底物，采用標準方法[19-20]測定脂肪酶活力；并進行SDS-PAGE電泳檢測和Western Blotting進一步鑒定。酶活力單位定義為每分鐘催化底物水解產(chǎn)生1μmol脂肪酸的酶量。

1.2.3 等離子突變株的選育及鑒定 使用ARTP育種機對轉(zhuǎn)化子進行等離子誘變。參照樣品制備流程制備樣品，選取時間梯度30、60、90、120、180s進行誘變，誘變后的菌液分別稀釋50、500、5000倍涂布于淀粉培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)5d。挑取菌落大的單菌落轉(zhuǎn)接于三丁酸甘油酯平板上，通過水解圈的大小初步判斷脂肪酶活力，對突變株進行篩選。

表1 PCR引物序列Table 1 The sequences of PCR primers

經(jīng)過二次篩選，選定水解圈最大的突變株單菌落研究，30℃、250r/min對其發(fā)酵，測定純化后突變株tll蛋白的濃度和脂肪酶活力。

1.2.4 耐熱脂肪酶的生物學(xué)特性 耐熱脂肪酶的最適反應(yīng)溫度：選取溫度梯度50、55、60、65、70、75、80℃，以橄欖油為底物進行脂肪酶活測定，酶活最高時的溫度即為重組耐熱脂肪酶的最適反應(yīng)溫度。

耐熱脂肪酶的最適反應(yīng)pH：以橄欖油為底物，調(diào)整反應(yīng)緩沖液pH分別為3.0、5.0、7.0、8.0、9.0、11.0，進行脂肪酶活測定，酶活最高時的pH即為重組耐熱脂肪酶的最適反應(yīng)pH。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐熱脂肪酶基因表達載體的構(gòu)建

通過融合PCR擴增耐熱脂肪酶基因（Sig-tll），電泳結(jié)果顯示基因片段大小與預(yù)計一致（圖2A），通過亞克隆得到耐熱脂肪酶的表達載體pHGWPT-tll（圖2B）。HindIII/XbaI雙酶切表達載體pHGWPT-tll，得到與目的片段大小相符的片段（約2.7K，圖2C），表明耐熱脂肪酶表達載體構(gòu)建成功。

圖2 Sig-tll基因的擴增及耐熱脂肪酶表達載體的酶切鑒定Fig.2 PCR amplification of Sig-tll gene and identification of its expression vector by enzyme digestion

2.2 黑曲霉轉(zhuǎn)化子的鑒定

挑選MM培養(yǎng)基上菌落大的單菌落（圖3A），轉(zhuǎn)移至三丁酸甘油酯平板。培養(yǎng)2d，出現(xiàn)水解圈的菌落，初步確定為轉(zhuǎn)化子，而宿主菌SH-2菌落周圍無水解圈（圖3B）。

圖3 pHGWPT-tll表達載體轉(zhuǎn)化無孢黑曲霉SH-2Fig.3 Transformation of sporeless A.niger SH-2 with expression vector pHGWPT-tll

分別以宿主菌SH-2和轉(zhuǎn)化子的基因組為模板，經(jīng)PCR擴增所得的glaA、HygBr及Sig-tll片段大小與預(yù)計一致（圖4A），且Sig-tll基因測序結(jié)果與原始序列一致，證實所得轉(zhuǎn)化子為陽性克隆。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化子在32ku處有蛋白條帶，與tll蛋白大小相符[16]，Western Blotting鑒定表明，轉(zhuǎn)化子有對應(yīng)耐熱脂肪酶tll的條帶，而宿主菌SH-2沒有（圖4B），進一步確定轉(zhuǎn)化子成功表達疏棉狀嗜熱絲孢菌耐熱脂肪酶。

圖4 轉(zhuǎn)化子的鑒定Fig.4 Verification of transformant

2.3 等離子突變株的鑒定

對轉(zhuǎn)化子進行等離子誘變，經(jīng)二次篩選得到突變株。結(jié)果顯示，宿主菌SH-2（圖5A，1）在三丁酸甘油酯平板不形成水解圈，轉(zhuǎn)化子（圖5B，1）形成明顯的水解圈。對水解圈最大的突變株（圖5B，2）進行發(fā)酵，純化后轉(zhuǎn)化子、突變株tll蛋白的濃度、脂肪酶活力及酶的比活力見表2。結(jié)果顯示，雖突變株和轉(zhuǎn)化子的脂肪酶活力相差不大，但同轉(zhuǎn)化子相比，突變株的比活力提高37%。此外，轉(zhuǎn)化子和突變株的脂肪酶活力分別達到36、35U/mL，遠高于疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶在畢赤酵母中的表達水平（7.2U/mL）[16]。

圖5 等離子突變株的篩選Fig.5 Screening of lipase mutant

表2 純化后轉(zhuǎn)化子、突變株tll蛋白濃度、酶活力及酶的比活力Table 2 Protein concentration,enzyme activity and specific activity of tll after purification

2.4 耐熱脂肪酶最適反應(yīng)溫度及最適反應(yīng)pH

不同pH緩沖液環(huán)境下，分別測定宿主菌SH-2和突變株的脂肪酶活力。結(jié)果顯示，宿主菌SH-2的脂肪酶活力在緩沖液pH為3.0～11.0之間較低且沒有明顯變化；突變株在緩沖液pH為3.0～11.0區(qū)間脂肪酶活力較高，且在緩沖液pH8.0時，酶活力最高，超過pH8.0酶活力顯著下降。

在不同溫度下分別測定宿主菌SH-2和突變株的脂肪酶活力。結(jié)果顯示，宿主菌SH-2的脂肪酶活力在50～80℃之間較低且無較大變化；突變株則在50～60℃區(qū)間保持較高酶活力，且酶活力在60℃時達到最高，超過60℃，酶活力顯著下降。上述結(jié)果與疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶在畢赤酵母中表達時基本一致[18]。

圖6 耐熱脂肪酶最適反應(yīng)pH及最適反應(yīng)溫度Fig.6 The optimum pH and optimum temperature of the tll lipase

3 結(jié)論

疏棉狀嗜熱絲孢菌耐熱脂肪酶具有作用溫度高、副產(chǎn)物少、作用穩(wěn)定等優(yōu)點，得到越來越多的關(guān)注。該酶傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法是通過內(nèi)源分泌得到的，產(chǎn)物量少、質(zhì)量參差不齊、無法產(chǎn)業(yè)化等限制了其應(yīng)用。目前，對疏棉狀嗜熱絲孢菌耐熱脂肪酶的重組表達研究較少，國外Wai Prathumpai等使用米曲霉淀粉酶啟動子將其在黑曲霉（NW297-14和NW297-24）中表達，但是酶活力較低。本研究對疏棉狀嗜熱絲孢菌耐熱脂肪酶基因進行密碼子優(yōu)化，使其自由能由-291.9kcal/mol降至-303.3kcal/mol。自由能降低，大大減少了mRNA兩端二級結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，增加mRNA穩(wěn)定性從而提高蛋白表達量。研究使用黑曲霉自身糖化酶強啟動子構(gòu)建質(zhì)粒，經(jīng)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化至無孢黑曲霉SH-2，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)后，穩(wěn)定性良好且脂肪酶活力達到36U/mL。在此基礎(chǔ)上，使用等離子誘變技術(shù)對轉(zhuǎn)化子進行誘變，效果顯著，實現(xiàn)了耐熱脂肪酶在無孢黑曲霉的重組高效表達。

本文采用的潮霉素抗性基因（HygBr）雖然在真菌研究中應(yīng)用極為廣泛，但潮霉素是一種細菌毒素，屬于氨基環(huán)多醇類抗生素，它可通過干擾蛋白合成而抑制原核和真核生物的生長，這極大的限制了其在食品等工業(yè)的應(yīng)用。因此選擇一種能夠應(yīng)用于食品工業(yè)的篩選標記如營養(yǎng)互補型選擇標記，使其能夠廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，為該酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供條件，這將是本課題今后深入研究的方向。

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Effectively expression of Thermomyces lanuginosus thermostable lipase in non-spore Aspergillus niger

CHEN Jing，WANG Bin，LI De-ming，PAN Li*
（School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China）

TS201.3

A

1002-0306（2012）20-0160-40

2012-04-23 *通訊聯(lián)系人

陳婧（1987-），女，碩士研究生，研究方向：工業(yè)微生物。

國家自然科學(xué)基金項目（30970045）；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃（2011AA100905）。