朱宇旌 潘香岑 張 勇* 李欣蔚 馬 勇 邵彩梅

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110866;2.遼寧禾豐牧業(yè)有限公司，沈陽 110164)

紅三葉(red clover)又叫紅車軸草、紅荷蘭翹搖，為豆科三葉草屬多年生牧草。紅三葉草在我國栽培廣泛，總異黃酮含量豐富。紅三葉異黃酮(red clover isoflavones，RCI)作為異黃酮類植物雌激素，在結(jié)構(gòu)上與內(nèi)源雌激素相似，能夠與雌激素受體(ERs)、孕激素受體和雄激素受體以低親和度結(jié)合而發(fā)揮弱雌激素樣效應(yīng)［1－2］。目前，食品和飼料工業(yè)中應(yīng)用的異黃酮主要來自大豆，但紅三葉各個(gè)部位異黃酮含量均高于大豆，且全株都可利用，成本比大豆低廉［3］，因而其開發(fā)利用日益受到人們的重視。RCI已經(jīng)成為國內(nèi)外繼大豆異黃酮之后又一種研究較多的植物雌激素。

1 RCI的結(jié)構(gòu)特征

RCI屬于4’－甲氧基類異黃酮，需要在生物體內(nèi)通過微生物酶系作用轉(zhuǎn)化成具有雙羥基結(jié)構(gòu)以及活性更高的4’－羥基類異黃酮，從而更好地與雌激素受體結(jié)合，發(fā)揮植物雌激素作用［4］。目前紅三葉中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)40多種異黃酮，可達(dá)干物質(zhì)含量的1.5%～2.5%，其中主要的4種雌激素為芒柄花素、鷹嘴豆芽素A(雞豆黃素A)、染料木素和大豆素(圖1［5］)，其含量是其他植物無法與之相比的。其中芒柄花素和鷹嘴豆芽素A含量尤為高，而且是大豆中不存在的異黃酮類化合物［6］，因此具有很高的開發(fā)價(jià)值。RCI在新鮮的植物體內(nèi)以糖苷的形式存在，在適宜的提取條件下發(fā)生水解或酶解，使大部分的糖苷轉(zhuǎn)化成苷元，而苷元才是其真正的有效成分。

2 RCI的提取、純化及鑒定

目前，RCI常用的幾種提取方法主要有乙醇浸提、加壓提取、堿水提取等。朱宇旌等［7］采用乙醇浸提法，結(jié)合超聲波輔助提取紅三葉中的總異黃酮，通過對(duì)提取劑乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間和料液比4因素3水平的正交試驗(yàn)，得出RCI的最佳提取工藝條件為:預(yù)浸時(shí)間8 h，乙醇濃度70%，料液比1∶25，提取溫度70℃，提取時(shí)間1 h。在此條件下RCI的提取量為24.6 mg/g，粗提物得率為24.74%，粗提物純度為5.99%。采用乙醇作為浸提液安全無毒，且價(jià)格低廉，可回收利用。楊薇薇等［8］采用加壓提取工藝，當(dāng)壓力為0.8 MPa，乙醇濃度為 50%，料液比為 1∶15，保壓時(shí)間為5 min時(shí)，紅三葉草總異黃酮得率為57.0 mg/g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.85%。加壓提取工藝與醇提法相比，是一種快速高效的新方法，但國內(nèi)研究少見。吳三林等［9］采用堿水為浸提液，最佳提取工藝為:提取溫度80℃，提取時(shí)間1 h，料液比1∶12，堿水 pH 為11，提取2次，總異黃酮提取率0.70%。該方法的優(yōu)點(diǎn)是降低工藝成本，缺點(diǎn)是提取過程中有效成分可能被分解。

圖1 紅三葉異黃酮的結(jié)構(gòu)式及組成Fig.1 Structure and composition of red clover isoflavones［5］

朱宇旌等［10］進(jìn)一步對(duì)所提取的RCI采用大孔吸附樹脂HPH 480進(jìn)行了純化，該工藝不僅吸附量大，而且解吸率高，適合其分離富集。動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)結(jié)果表明:RCI較好的動(dòng)態(tài)吸附工藝參數(shù)為上樣液濃度0.8～1.3 mg/mL，上樣液pH為5，徑高比1∶20，流速2 mL/min，室溫下上樣，采用70%乙醇室溫洗脫，流速為1.0 mL/min，洗脫劑用量為4 BV，在此條件下得到的RCI純度為25%以上，較粗提物提高4倍以上。采用樹脂吸附法與溶劑萃取法聯(lián)用對(duì)RCI進(jìn)行精制以乙酸乙酯萃取效果較好，可使RCI純度達(dá)到32.29%;采用樹脂吸附法與重結(jié)晶法聯(lián)用，純度可達(dá)44.78%，但重復(fù)性差。

常平等［11］采用高效液相色譜法對(duì)紅三葉草中4種主要異黃酮物質(zhì)含量進(jìn)行了鑒定，得出紅三葉草中主要異黃酮物質(zhì)含量分別為大豆黃素0.43% ～0.60%、染料木素0.35% ～0.64%、芒柄花素4.79%～9.29%和鷹嘴豆芽素A 1.32%～2.63%。

3 RCI的生理功能

RCI是一類具有營養(yǎng)作用和治療意義的非固醇類物質(zhì)，是目前國際上公認(rèn)的安全有效的天然植物雌激素。RCI不僅在醫(yī)學(xué)上具有提高機(jī)體免疫力、抗微生物、抑制炎癥［12］、抗氧化和抗自由基形成［13］、強(qiáng)心降血脂、預(yù)防高血壓［14］、控制焦慮癥［15］等作用，而且適量應(yīng)用于動(dòng)物飼料還有促進(jìn)動(dòng)物生長、提高飼料利用率、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)、促進(jìn)生殖系統(tǒng)發(fā)育、提高泌乳和繁殖力等作用，并且具有劑量小、見效快、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)［16－17］。

3.1 RCI的雌激素與抗雌激素作用

RCI的4種主要成分均具有雌性激素作用，它們的特殊之處在于:1)幾乎能分布到機(jī)體的每個(gè)細(xì)胞中去發(fā)揮作用，這是機(jī)體自身分泌的激素所不能達(dá)到的。2)具有雙向調(diào)節(jié)作用，在機(jī)體內(nèi)源性雌激素水平較低時(shí)表現(xiàn)為雌激素激動(dòng)劑的作用;而當(dāng)體內(nèi)雌激素水平偏高時(shí)，它占據(jù)雌激素受體表現(xiàn)為抗雌激素作用。動(dòng)物體內(nèi)雌激素的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)存在3條途徑:通過腦垂體產(chǎn)生的激素來調(diào)節(jié)雌激素的分泌;通過卵巢功能進(jìn)行反饋性調(diào)節(jié);通過一些生長因子和細(xì)胞因子進(jìn)行調(diào)節(jié)。腦垂體能生成黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、卵 泡 刺 激 素 (follicle－stimulating hormone，F(xiàn)SH)、催乳素(prolactin，PRL)和促性腺激素釋放激素(GnRH)等激素，其中LH對(duì)卵巢產(chǎn)生雄激素具有很強(qiáng)的刺激作用，成為內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的主要因素。

圖2－A顯示在繁殖期間，雌二醇的大量分泌會(huì)反饋給下丘腦，而后下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)的釋放會(huì)引起GnRH以低頻的脈沖形式進(jìn)行釋放。在下丘腦雙向調(diào)節(jié)雌激素釋放的過程中，α型雌激素是感受神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)的主要雌激素類型。當(dāng)體內(nèi)雌激素水平分泌過高時(shí)，RCI可占據(jù)雌激素受體，使體內(nèi)分泌的過量的雌激素不能與受體結(jié)合，從而不能發(fā)揮作用。圖2－B顯示當(dāng)雌激素分泌量減少時(shí)，同樣會(huì)反饋給下丘腦，此時(shí)下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)的釋放則會(huì)增加GnRH的釋放頻率。參與調(diào)節(jié)的神經(jīng)遞質(zhì)同樣是調(diào)節(jié)心率和體溫的重要因子，因此這也是雌性激素減少以后會(huì)相應(yīng)引起潮熱和心率加快的原因。外源性添加RCI則可消除雌激素缺乏對(duì)下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)釋放的反饋調(diào)節(jié)，因此，RCI可以緩解女性雌激素分泌量減少引起的潮熱和心率加快癥狀。

圖2 下丘腦-垂體-卵巢軸的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)控回路Fig.2 The neuroendocrine circuit of the hypothalamo － pituitary － ovarian axis［18］

3.2 RCI的抗腫瘤作用

RCI可以降低乳腺癌的發(fā)病率。目前認(rèn)為RCI的防癌機(jī)理在于RCI能優(yōu)先與雌激素受體結(jié)合，抑制其循環(huán)轉(zhuǎn)換成雌二醇類固醇的前體酶，抑制細(xì)胞信號(hào)途徑的信號(hào)傳遞［19］。

腫瘤細(xì)胞的增殖受某些生長因子和雌二醇調(diào)控(圖3)［19］。生長因子信號(hào)通過膜受體激活磷脂酰肌醇3－激酶/蛋白激酶B(PI3－K/AKT)和絲裂原活化蛋白激酶的激酶－細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2(MEK/ERK1/2)等細(xì)胞信號(hào)途徑［20］。激活的雌二醇受體與這些信號(hào)途徑相互作用，這一過程可能涉及膜關(guān)聯(lián)雌二醇受體的參與［21－22］。相反，激酶信號(hào)途徑可能激活細(xì)胞內(nèi)的雌激素受體［23］。一些植物雌激素是細(xì)胞信號(hào)途徑中的抑制因子，或者是雌激素受體的弱配體，例如染料木黃酮是酪氨酸激酶的抑制蛋白，而芹黃素則是PI3－K信號(hào)途徑的抑制因子，因此植物雌激素可以抑制生長因子誘導(dǎo)的MEK/ERK1/2和PI3－K/AKT信號(hào)通路，抑制腫瘤的生長［24］。有研究表明，白藜蘆醇能抑制Src酪氨酸激酶，同時(shí)，通過雌激素受體α(ERα)依賴型機(jī)制調(diào)節(jié) PI3－K 信號(hào)途徑［25］。盡管需要高劑量的使用上述植物雌激素才能達(dá)到抑制細(xì)胞信號(hào)途徑的效果，但這些植物雌激素在調(diào)整癌細(xì)胞的生長方面可能會(huì)起到關(guān)鍵作用。

圖3 紅三葉異黃酮的抗腫瘤作用機(jī)制Fig.3 The antitumor mechanism of red clover isoflavones［19］

3.3 RCI的抗氧化作用

植物雌激素具有多個(gè)選擇性雌激素受體調(diào)控元件的活性，可與轉(zhuǎn)錄因子如核轉(zhuǎn)錄因子 κB(NF－κB)相互作用，發(fā)揮抗氧化活性［26］。RCI的分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基，因而具有抗氧化作用。RCI可作為自由基的供氫體，抑制自由基產(chǎn)生和消除自由基，保護(hù)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、染色體免受活性氧的攻擊，減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生和阻斷脂質(zhì)過氧化物的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來發(fā)揮抗氧化作用。

天然抗氧化劑加強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，以減少氧化應(yīng)激產(chǎn)生中毒性疾病的危險(xiǎn)［27］。消除自由基可以防御細(xì)胞免受其有害影響。多不飽和脂肪酸作為細(xì)胞膜的主要成分特別容易受到自由基的介導(dǎo)，因?yàn)槠浜械墓曹楁I結(jié)構(gòu)，脂質(zhì)過氧化過程會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的紊亂［28］。人體中的活性氧和自由基是引發(fā)衰老、癌變和細(xì)胞損傷的重要原因。RCI能保護(hù)DNA不被氧化破壞，有效消除DNA的氧化損傷。羥自由基、超氧自由基清除試驗(yàn)及對(duì)豬油抗氧化試驗(yàn)表明，RCI有較強(qiáng)的消除羥自由基、超氧陰離子自由基和抑制脂質(zhì)過氧化作用，且隨添加量的增加，RCI抗氧化作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)添加量達(dá)到4 mg/mL時(shí)，其抗氧化效果與0.02%的人工合成抗氧化劑2，6－二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)相接近［29］。

3.4 潛在的抗病毒功能

大豆異黃酮中的染料木素可以抑制包膜或無包膜病毒，單鏈或雙鏈DNA或RNA病毒的感染，包括腺病毒的感染、單一皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和輪狀病毒，以減少它們動(dòng)物的影響［30］。雖然RCI的抗病毒特性研究開展的不多，但因?yàn)镽CI中主要成分也是染料木素，可以推測(cè)RCI具有抗病毒作用，但這還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.5 RCI對(duì)雌激素受體轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)

圖4顯示一旦雌激素受體形成二聚體且配體結(jié)合到E/F結(jié)構(gòu)域，雌激素受體即被活化，激素受體活化功能區(qū)1(AF－1)和活化功能區(qū)2(AF－2)就可以結(jié)合共調(diào)節(jié)因子?；罨拇萍に厥荏w既可以結(jié)合到DNA的雌激素效應(yīng)元件(estrogen response element，ERE)上，也可結(jié)合到其他效應(yīng)元件上，諸如活化蛋白 1(AP－1)和 I型類固醇因子(SF－1)。AF－2的轉(zhuǎn)錄過程在 ERα和雌激素受體 β(ERβ)這2種受體中比較類似。AF－1的轉(zhuǎn)錄活性在ERβ中很低甚至可以忽略。

圖4 ERα和ERβ的結(jié)構(gòu)與激活Fig.4 The structure and the activation of estrogen receptors α and β［19］

ERα和ERβ在不同基因上編碼，類固醇受體的不同結(jié)構(gòu)域表明這2種受體存在一定程度的同源性，同時(shí)，這2種受體的DNA連接結(jié)構(gòu)域也具有高度的同源性，且配體連接E結(jié)構(gòu)域也有60%的同源［31］。因此，雌激素對(duì)于 ERα 和 ERβ，具有相似的親和力。由于這2種受體均具有2個(gè)活化功能區(qū)AF－1和AF－2，且這2個(gè)受體活化功能區(qū)一旦被激活，就可以結(jié)合基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，所以2種受體其C末端的AF－2的轉(zhuǎn)錄激活都依賴于配體結(jié)合。然而N末端AF－1的激活涉及到蛋白質(zhì)間的相互作用，故在不存在任何雌性激素配體的情況下依然能夠結(jié)合調(diào)節(jié)因子［32］。在此情況下，只有ERα可引起顯著的轉(zhuǎn)錄激活。所以AF－1和AF－2 對(duì) ERα 的促轉(zhuǎn)錄活性遠(yuǎn)大于 ERβ［33］。ERα的轉(zhuǎn)錄加強(qiáng)可阻斷細(xì)胞生長因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制癌細(xì)胞的生長［34］。RCI中的4種成分在機(jī)體中均可以發(fā)揮植物雌激素的作用，但RCI在機(jī)體內(nèi)對(duì)2種受體的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)的機(jī)制還不清楚。

4 RCI對(duì)畜禽生長、免疫、繁殖和骨骼發(fā)育的影響

4.1 生長性能

RCI作為外源性弱的雌激素可與內(nèi)源性雌二醇競(jìng)爭(zhēng)下丘腦、垂體雌二醇受體，干擾性激素的正常反饋調(diào)節(jié)機(jī)能，使內(nèi)源性激素水平提高或降低，進(jìn)而使生長激素(GH)水平發(fā)生相應(yīng)變化。而GH又通過胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF－Ⅰ)的介導(dǎo)，促進(jìn)組織的生長和發(fā)育。飼糧中添加4.38 mg/kg RCI時(shí)，雄性肉雞日增重提高了5.1%，料重比下降了9.2%，提高了飼料的利用率，說明RCI可能通過改變內(nèi)源激素水平從而間接促進(jìn)公雞肌肉生長［35］。朱宇旌等［36］在肉雞飼糧中添加 20 mg/kg RCI時(shí)，肉雞整個(gè)生長階段表現(xiàn)的生長性能顯著優(yōu)于對(duì)照組，肉雞平均體增重提高6.86%。姜義寶等［37］也試驗(yàn)證明在肉雞飼糧中添加20 mg/kg RCI時(shí)促生長效果較好，認(rèn)為RCI可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)GH、IGF－Ⅰ、三甲狀腺原氨酸(T3)和甲狀腺素(T4)水平來影響肉雞的生長性能。但RCI對(duì)動(dòng)物的生長具有雙向作用，添加量過多，生長性能反而呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。在肉雞飼糧中添加5～20 mg/kg RCI時(shí)，肉雞平均體增重隨添加劑量的增加而提高，當(dāng)RCI添加量達(dá)到30 mg/kg時(shí)，肉雞的平均體增重、耗料量和料重比呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。因此，高劑量的RCI不僅不會(huì)促進(jìn)動(dòng)物生長，反而抑制其生長［37］。

4.2 免疫功能

RCI對(duì)動(dòng)物免疫功能具有增強(qiáng)和抑制的雙向調(diào)節(jié)作用，對(duì)機(jī)體的細(xì)胞、體液及非特異性免疫功能有不同程度的影響。目前認(rèn)為雌激素對(duì)免疫的調(diào)節(jié)作用是通過位于免疫器官或免疫細(xì)胞上的雌激素受體而發(fā)揮作用的。異黃酮直接作用于免疫器官(如胸腺)或各種免疫細(xì)胞上的雌激素受體，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，并且存在劑量效應(yīng)。

張勇等［38］試驗(yàn)表明，適量的RCI提取物能夠促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，且對(duì)胸腺系數(shù)的影響呈劑量依賴效應(yīng);RCI促進(jìn)小鼠非特異性免疫功能，較高劑量的RCI使小鼠血清溶血水平明顯上升，同時(shí)激發(fā)了小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)。飼糧中添加RCI能顯著增加肉雞免疫器官法氏囊重，并顯著提高血清總蛋白和球蛋白含量。飼糧中添加20 mg/kg RCI顯著提高了產(chǎn)蛋后期母雞脾臟指數(shù)(較對(duì)照組提高了61.6%)［39］。在研究中我們還發(fā)現(xiàn)，RCI具有明顯的雙向調(diào)節(jié)作用，在低劑量時(shí)表現(xiàn)出對(duì)生長免疫的促進(jìn)作用，但高劑量時(shí)卻表現(xiàn)為抑制作用［40］。免疫抑制效應(yīng)在臨床上的意義表現(xiàn)在:一方面，免疫抑制對(duì)自身免疫性疾病有積極的影響;另一方面，在感染的防御過程中，RCI可減少有機(jī)體對(duì)免疫反應(yīng)產(chǎn)生的不利影響。從細(xì)胞生物學(xué)和動(dòng)物試驗(yàn)得出的證據(jù)表明，雌激素對(duì)免疫系統(tǒng)有重要的影響。人類疾病如自身免疫性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，自身免疫性腎小球性腎炎，甚至惡性疾病如白血病均與雌激素分泌有關(guān)［18］。

4.3 繁殖性能

RCI對(duì)動(dòng)物的生殖器官具有一定的影響。有研究表明攝入RCI的母羊，體內(nèi)各器官的異黃酮含量分布腎中最高，卵巢、子宮含量居中［5］，提示RCI對(duì)動(dòng)物生殖性能有一定影響。紅三葉草中的提取物已被證明能抑制芳香酶活性，抑制炎癥發(fā)生［41］。動(dòng)物研究表明，RCI影響機(jī)體的生殖發(fā)育，當(dāng)給予高劑量的大豆素和染料木素，青春期大鼠在子宮有調(diào)節(jié)性激素受體基因的表達(dá)［42］。另外，RCI還可改善去卵巢大鼠的子宮萎縮狀況，發(fā)揮一定的雌激素作用［43］。

4.4 骨骼發(fā)育

RCI與動(dòng)物的骨吸收及骨代謝密切相關(guān)。動(dòng)物體內(nèi)雌激素的分泌隨著年齡的增長而降低，由于雌激素水平的下降，體內(nèi)骨代謝平衡破壞，使骨吸收大于骨形成，骨量逐漸減少，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率增高。而RCI能夠與雌激素受體以低親和度結(jié)合而發(fā)揮雌激素樣效應(yīng)［44］，可抑制骨吸收，減少骨丟失，有效預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。飼料中隨著RCI添加水平的提高，血清鈣含量呈升高趨勢(shì)，添加20 mg/kg RCI可顯著提高產(chǎn)蛋后期雞的脛骨灰分含量［37］。通過對(duì)去卵巢大鼠研究發(fā)現(xiàn)，RCI高劑量組的骨密度、骨礦物質(zhì)元素含量均顯著高于模型組，接近于雌激素組，低劑量組則沒有效果，說明RCI在一定劑量下可通過抑制破骨細(xì)胞的發(fā)育和分化，維持骨密度值處于相對(duì)穩(wěn)定的水平，增加其骨質(zhì)量，從而達(dá)到防治骨質(zhì)疏松癥的目的［45］。

5 小結(jié)

紅三葉草中主要含異黃酮的活性成分包括大豆黃素、染料木素、芒柄花素和鷹嘴豆芽素 A。RCI同時(shí)具有雌激素與抗雌激素作用，可調(diào)控雌激素受體轉(zhuǎn)錄，還具有體內(nèi)抗氧化作用。畜禽飼料中合理利用可提高其生產(chǎn)性能，改善畜禽健康水平，提高繁殖性能，促進(jìn)骨骼發(fā)育。盡管RCI在畜禽生產(chǎn)中發(fā)揮作用的機(jī)理仍需進(jìn)一步深入研究，但因其安全無毒、添加量少、效果顯著，在動(dòng)物營養(yǎng)領(lǐng)域的研究中日益受到關(guān)注，是一種極具開發(fā)前景的新型綠色飼料添加劑。

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