韓 勇

（日照市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東日照 276800）

偽狂犬病（pseudorabies，PR）是豬皰疹病毒Ⅰ型引起的一種多種家畜感染得的急性傳染病。其特征為發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎，可引起妊娠母豬繁殖障礙、流產(chǎn)、死胎、呼吸癥狀，新生仔豬除出現(xiàn)神經(jīng)癥狀外還可侵害消化系統(tǒng)。臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、生長不良等。在自然條件下豬、牛、綿羊、犬、貓、兔、鼠等及多種野生動(dòng)物都能發(fā)生感染。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)豬和鼠類是自然界中病毒的主要貯存宿主，也是引起其他家畜發(fā)病的疫源動(dòng)物。豬既是本病原的原發(fā)感染宿主，又是病毒的長期貯存者和排毒者，在偽狂犬病的傳播上起著重要作用。山東省日照市某豬場發(fā)生臨床癥狀相似的傳染病，從病豬腦部采集病料，對(duì)病毒進(jìn)行分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 可疑病料采自山東省日照市某豬場病豬腦部，PRV陽性血清、PRV陰性血清和PRV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株（閩A株）、PK-15細(xì)胞均由日照市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心試驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)試劑 明膠、DMFM購J-Sigma公司，新生犢牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所。

1.3 病料處理 無菌取病豬腦部與PBS（0.1 M，pH7.2）以V/V 1:5制成勻漿，反復(fù)凍融3次，3 000 r/min，離心15 min，取上清中加雙抗，37 ℃作用18 h，經(jīng)0.45 μm濾膜除菌。

1.4 小鼠接種試驗(yàn) 取10只8周齡Balb/c小鼠，其中4只腹腔注射病料濾液，0.2 mL/只，另4只背部脊柱附近皮下注射病料濾液，0.2 mL/只，接種后觀察小鼠的采食、飲水、精神狀況及臨床表現(xiàn)。

1.5 細(xì)胞接種試驗(yàn) 接種0.5 mL病毒濾液于長成單層的細(xì)胞，連續(xù)觀察，直到出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）為止。

1.6 分離毒的毒價(jià) 滴定PK-15細(xì)胞培養(yǎng)于96孔細(xì)胞板上，待細(xì)胞生長成單層，分離病毒作10倍系列稀釋（病毒濃度為10-1～10-10），每個(gè)稀釋度接種8孔。每孔0.1 mL，第11、12列為空白對(duì)照。記錄各個(gè)梯度的病變數(shù)，連續(xù)觀察5 d，用Karber法計(jì)算出分離毒的TC1D50[1]。

1.7 微量中和試驗(yàn)鑒定分離毒（固定病毒稀釋血清法）將PRV陰性血清和陽性血清分別進(jìn)行10倍系列稀釋（血清濃度為10-1～10-10），加等量的200 TCID50，37 ℃感作20 min。分別接種96孔板單層PK-15細(xì)胞，每孔0.1 mL。每個(gè)稀釋度接種8孔，第11列為空白對(duì)照，第12列為標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株對(duì)照（200TC1D50）。記錄各個(gè)梯度的細(xì)胞病變數(shù)，連續(xù)觀察5 d。同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株（閩A株）與陽性血清及標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株（閩A株）與陰性血清對(duì)照，方法同上。

1.8 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)基因庫的PRV gE基因設(shè)計(jì)1對(duì)引物鑒定該病毒。

上游引物：5'-agt act cgc agg ggc gca act -3'下游引物3'-tgt gga tgt ggt tct agc cgc-5'

1.9 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

將病毒接種PK-15細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80%以上時(shí)收集細(xì)胞。用常規(guī)方法提取病毒DNA，用TE溶液溶解沉淀，分裝備用-70 ℃凍存[2]，按照寶生物工程（大連）有限公司LA PCR試劑盒說明進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序 94 ℃ 5 min、94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、2 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。最后取PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠接種試驗(yàn) 小鼠接種病料12 h后，打盹、不愛活動(dòng)。其中1只小鼠出現(xiàn)后肢麻痹，可能是病毒侵入神經(jīng)引起麻痹，48 h后2只小鼠出現(xiàn)被毛逆立，60 h后3只小鼠死亡，直到72 h共死亡6只。

2.2 細(xì)胞病變的觀察 PH-15細(xì)胞接種病料12 h后出現(xiàn)空洞、細(xì)胞變圓，第24 h出現(xiàn)明顯的拉網(wǎng)病變，48 h細(xì)胞脫落。

2.3 分離毒的毒價(jià)滴定 不同稀釋度的病毒在96孔細(xì)胞板PK-15細(xì)胞單層出現(xiàn)的CPE，結(jié)果見表1，參照公式TC1D50= 1，+ d（S-0.5）[3]計(jì)算該病毒在V ero細(xì)胞培養(yǎng)物的毒價(jià)為10-9.45/0.1 mL。

2.4 微量中和試驗(yàn)結(jié)果分析 PRV陽性血清特異中和分離毒，抑制細(xì)胞病變，說明所分離的病毒是偽狂犬病毒。

表1 不同稀釋度的病毒出現(xiàn)的CPE

2.5 PCR反應(yīng)結(jié)果分析 瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果表明，擴(kuò)增出的片段大小約為485 bp，與預(yù)期長度相符。如下圖1。

3 討論

分離偽狂犬病毒可以將采集的樣品勻漿接種易感細(xì)胞加以增殖，通過特異性抗血清中和試驗(yàn)檢測特異性細(xì)胞病變加以鑒定，還可以用PCR來鑒定。作者從急性死亡病豬腦部分離出的病毒，經(jīng)過動(dòng)物接種試驗(yàn)、細(xì)胞接種試驗(yàn)及對(duì)其毒價(jià)進(jìn)行滴定初步判斷其為偽狂犬病毒；經(jīng)中和試驗(yàn)PRV陽性血清能夠特異中和分離毒，抑制細(xì)胞病變；根據(jù)PRV gE基因設(shè)計(jì)的引物對(duì)分離毒DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，可擴(kuò)增出特異性條帶。以上結(jié)果，鑒定分離毒為偽狂犬病毒。

[1]杜念興.獸醫(yī)免疫學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1995：589-590.

[2]殷震.動(dòng)物病毒學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，1997：988-1009.

[3]范偉興，劉文強(qiáng).三種PCR方法診斷豬偽狂犬病的比較研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，25（4）：294-298.