劉春蕾， 李 鑫， 李蕊君， 何云云， 何昆侖△， 王莉莉

(1中國人民解放軍總醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100853;2南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071;3軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850)

PERK通路參與了缺氧心肌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡*

劉春蕾1，2， 李 鑫1， 李蕊君1， 何云云1，2， 何昆侖1△， 王莉莉3△

(1中國人民解放軍總醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100853;2南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071;3軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850)

目的:觀察缺氧對原代培養(yǎng)的Wistar乳鼠心肌細(xì)胞的損傷，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在缺氧心肌損傷發(fā)生發(fā)展過程中起的作用及PERK通路是否參與其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。方法:將原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞隨機分為正常對照組和缺氧1 h、4 h、8 h、12 h、24 h組，通過測定細(xì)胞ATP含量反映細(xì)胞活力;高內(nèi)涵分析細(xì)胞成像系統(tǒng)檢測多參數(shù)凋亡;采用免疫細(xì)胞化學(xué)和蛋白印跡方法檢測以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為靶點的分子伴侶(GRP78和鈣網(wǎng)蛋白)的表達(dá)，PERK通路(PERK和eIF2α)的磷酸化水平，以及其下游分子(ATF4和CHOP)在缺氧不同時點蛋白的表達(dá)變化特征。采用PERK通路激活型藥物salubrinal處理原代培養(yǎng)的Wistar乳鼠心肌細(xì)胞，觀察藥物是否對缺氧損傷的心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。結(jié)果:缺氧引起心肌細(xì)胞凋亡，缺氧早期(約1 h)鈣網(wǎng)蛋白和GPR78的表達(dá)上調(diào);缺氧中期(4 h)p－PERK、p－eIF2α和ATF4的表達(dá)上調(diào);缺氧后期(12 h)CHOP的表達(dá)上調(diào)。Salubrinal對缺氧心肌有保護(hù)作用。結(jié)論:在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，缺氧可激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在缺氧早期激活PERK通路保護(hù)機體對抗缺氧損傷，后期激活細(xì)胞凋亡通路。

心肌細(xì)胞;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;缺氧;未折疊蛋白反應(yīng);細(xì)胞凋亡

心肌缺血觸發(fā)心肌細(xì)胞發(fā)生持續(xù)性凋亡反應(yīng)，使心肌細(xì)胞進(jìn)行性丟失、膠原支架斷裂、心室擴張和心室重塑，是多種心臟不良事件發(fā)生的重要原因［1］。因此，深入闡明缺氧心肌細(xì)胞凋亡的分子機制可望為缺血缺氧相關(guān)的心臟疾病提供新的有效干預(yù)手段。

傳統(tǒng)的細(xì)胞凋亡的途徑又稱caspase依賴的細(xì)胞死亡途徑，主要包括死亡受體途徑和線粒體途徑，兩者均通過誘導(dǎo)caspase級聯(lián)反應(yīng)激活caspase－3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。近年的研究顯示，除了caspase依賴的細(xì)胞凋亡途徑外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)也與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［2］。ERS是由于細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的改變引起ER內(nèi)未折疊蛋白質(zhì)聚集，鈣穩(wěn)態(tài)失衡，從而導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂的狀態(tài)。在ERS早期，未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)是重要特征，具有保護(hù)細(xì)胞抵抗外界環(huán)境對細(xì)胞的干擾作用;然而，一旦ERS持續(xù)而嚴(yán)重，則激活凋亡通路而誘發(fā)細(xì)胞凋亡［3］。研究表明，UPR可由3條獨立的信號通路所誘導(dǎo)，包括活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)、肌醇需酶(inositol－requiring enzyme 1，IRE1)和蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R－like ER kinase，PERK)［4］。目前，在心肌細(xì)胞中，缺氧誘發(fā)細(xì)胞ERS以及凋亡已經(jīng)得到廣泛證實。Negoro等［5］和 Ron等［6］觀察到，缺氧確能誘導(dǎo)新生乳鼠心肌細(xì)胞產(chǎn)生UPR反應(yīng)。也有研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞在缺氧條件下，ATF6通路蛋白表達(dá)上調(diào)［7］，誘發(fā)ATF6和IRE1通路共同的下游分子X盒結(jié)合蛋白1(X－box－binding protein 1，XBP1)及凋亡蛋白的表達(dá)，并隨著缺氧時間延長，最終使細(xì)胞死亡［8］。由此可見，ATF6和IRE1通路參與了缺氧心肌細(xì)胞ERS及凋亡。相比較ATF6和IRE1通路而言，PERK抑制蛋白合成途徑，更容易通過增強核糖體真核生物起始因子2(eukaryotic initiation factor 2，eIF2α)磷酸化酶的活性或抑制其去磷酸化酶的活性，抑制細(xì)胞凋亡。然而，PERK通路是否也參與了心肌細(xì)胞缺氧過程尚不清楚。本實驗通過缺氧誘導(dǎo)原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞凋亡，采用免疫細(xì)胞化學(xué)和蛋白印跡的方法，觀察了缺氧不同時間對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，特別是PERK通路相關(guān)蛋白的變化特點，旨在揭示PERK信號通路與缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的關(guān)系。

材料和方法

1 材料

新生24 h內(nèi)的Wistar大鼠，雌雄不拘(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供)，動物合格證號為SCXK－(軍)2007－004。小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體、兔抗大鼠葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)78(glucoseregulated protein，GRP78)多克隆抗體購自Stressgen。兔抗大鼠鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，Cal)多克隆抗體、兔抗大鼠phospho－PERK多克隆抗體、兔抗大鼠PERK多克隆抗體、兔抗大鼠eIF2α多克隆抗體、兔抗大鼠phospho－eIF2α多克隆抗體和小鼠抗大鼠C/EBP同源蛋白質(zhì)(C/EBP homologous protein，CHOP)多克隆抗體購自Cell Signaling Technology。兔抗大鼠活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)多克隆抗體購自Abcam。山羊抗小鼠IgG DylightTM594購自 Thermo scientific。ATP試劑盒購自 Promega。Salubrinal(Sal)和Hoechst 33258購自Invitrogen。高內(nèi)涵分析系統(tǒng) In cell Analyzer 2000為 GE產(chǎn)品; Western blotting成像與分析采用的Alphamager 5500凝膠成像系統(tǒng)為Alpha產(chǎn)品。

2 方法

2.1 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 迅速取出新生Wistar大鼠心臟，剪碎，用終濃度為0.125%胰蛋白酶和0.1%膠原酶在37℃水浴中消化20 min，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中和蛋白酶，將細(xì)胞懸液離心并重懸細(xì)胞接種至75 cm2培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h后半量換液;之后每48 h換液1次。4 d后，缺氧處理的細(xì)胞置于密閉的恒溫缺氧倉內(nèi)，通入95%N2/5%CO2的混合氣體，O2含量少于0.5%。

2.2 細(xì)胞活力測定 純化的乳鼠心肌細(xì)胞按1× 104cells/well接種到96孔板37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)4 d，之后置缺氧箱中分別缺氧處理細(xì)胞1 h、4 h、8 h、12 h、24 h，每時點設(shè)3個重復(fù)孔。同時設(shè)置藥物干預(yù)組，細(xì)胞缺氧處理前 24 h使用不同濃度的PERK通路激活型藥物salubrinal孵育心肌細(xì)胞30 min，按照細(xì)胞活力檢測試劑盒說明檢測細(xì)胞活性。采用酶標(biāo)儀檢測562 nm波長下的熒光值。

2.3 多參數(shù)凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡［9］每孔加入10 000個細(xì)胞，在37℃、95%N2、5%CO2的缺氧箱中孵育36 h，加入5%線粒體膜電位和DNA熒光素染料MitoTracker/Hoechst溶液，室溫染色10 min，PBS清洗后，細(xì)胞進(jìn)行透化處理，鬼筆環(huán)肽(Alexa Fluor 488 phalloidin solution)室溫暗處理30 min。剩余的溶液用PBS洗3次。應(yīng)用特異性的DNA熒光素染料 Hoechst 33258，線粒體膜電位染料 Mito-Tracker，細(xì)胞骨架染料Alexa Fluor 488進(jìn)行染色后，用高內(nèi)涵分析細(xì)胞成像系統(tǒng)在波長350/461 nm、495/519 nm和579/599 nm下進(jìn)行檢測觀察。檢測內(nèi)容包括細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞核面積、DNA含量、核強度、肌動蛋白含量、線粒體膜電位等指標(biāo)。正常細(xì)胞核為圓形或橢圓形，熒光著色淺，凋亡細(xì)胞核固縮，呈強熒光反應(yīng);與正常細(xì)胞相比，凋亡細(xì)胞骨架微絲蛋白含量降低，線粒體膜電位下降等現(xiàn)象

2.4 Western blotting法檢測心肌細(xì)胞蛋白表達(dá) 純化的乳鼠心肌細(xì)胞按1×106cells/well接種到6孔板，在37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)4 d后，在95%N2、5%CO2的缺氧箱中孵育不同時間。用1%SDS裂解液(mmol/L:NaCl 100，EDTA 0.1，DTT 10，HEPES 50)處理心肌細(xì)胞，離心取上清，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。于100℃水浴加熱10 min，12 000×g、4℃離心10 min。經(jīng)10%SDS－PAGE電泳分離后，將目標(biāo)條帶電轉(zhuǎn)至PVDF膜，其中PERK和p－PERK用25 V半干式轉(zhuǎn)移30 min，其余采用15 V半干式轉(zhuǎn)移15 min;之后，采用5%脫脂奶粉室溫封閉電轉(zhuǎn)后的PVDF膜1 h，Ⅰ抗分別為GRP78(1∶1 000)、calreticulin(1∶200)、PERK(1∶1 000)、p－PERK(1∶1 000)、phospho－eIF2α(1∶1 000)、eIF2α(1∶1 000)、ATF4(1∶500)、GAPDH(1∶200)、β－actin(1∶500)，4℃孵育過夜，TBS/T洗3次，加入Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBS/T洗3次;之后加SuperECL Plus超敏發(fā)光液避光孵育 3 min，最后采用 AlphaImager 5500凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像拍攝。用 FluorChem 5500進(jìn)行蛋白量灰度分析。

2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測CHOP蛋白表達(dá) 純化的乳鼠心肌細(xì)胞按1×104cells/well接種到黑色底透96孔板，在37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)4d后，置于37℃、95%N2和5%CO2缺氧箱中孵育不同時間。之后，細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min。封閉液室溫封閉1 h;1∶1 600稀釋Ⅰ抗CHOP，4℃孵育過夜; PBS洗3次，隨后用含Hoechest 33258(3 μmol/L)的熒光Ⅱ抗(1∶500)37℃孵育2 h。洗后，用In Cell Analyzer 1000高內(nèi)涵分析細(xì)胞成像系統(tǒng)檢測，采用In Cell Analyzer Workstation進(jìn)行熒光強度分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，組間比較采用單因素方差分析(One way－ANOVA)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 缺氧對大鼠心肌細(xì)胞ATP含量的影響

細(xì)胞ATP含量測定表明，與正常對照組相比，缺氧1 h、4 h、8 h、12 h、24 h后，細(xì)胞ATP含量顯著下降(P＜0.05)，隨著缺氧時間的延長，細(xì)胞ATP含量呈減低趨勢，但缺氧4 h較缺氧1 h有一升高，見圖1。

Figure 1. The effect of hypoxia on the viability of primary neonatal rat cardiomyocytes at different time points.x珋±s.n=3.*P＜0.05 vs control(non－h(huán)ypoxia treatment) group.圖1 缺氧不同時點對原代培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞ATP含量的影響

2 凋亡心肌細(xì)胞的鑒定

多參數(shù)凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示:缺氧后，細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、骨架微絲蛋白含量下降、線粒體膜電位下降等凋亡細(xì)胞的特征，見圖2。從這3個參數(shù)的數(shù)據(jù)分析顯示缺氧16 h和24 h造成明顯的細(xì)胞凋亡，核熒光強度分別較對照組高26.3%和26.6%;細(xì)胞骨架微絲含量分別較對照組低5%和11%;線粒體膜電位分別較對照組低17%和27%(P＜0.05)。

Figure 2. The effect of hypoxia on the apoptosis of the cardiomyocytes detected by high－content analysis.A:the images with nuclear staining，F(xiàn)－actin staining and mitochondrial membrane potential staining under normoxia or hypoxia for 24 h(×400);B: the nuclear intensity，F(xiàn)－actin content and mitochondrial membrane potential were statistical analyzed.珋x±s.n=3.*P＜0.05 vs control group(0 h).圖2 多參數(shù)檢測缺氧不同時間后心肌細(xì)胞的凋亡情況

3 Sal對缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞ATP含量的影響

細(xì)胞ATP含量測定發(fā)現(xiàn)，提前30 min給予心肌細(xì)胞salubrinal 10、20、40 μmol/L，再缺氧培養(yǎng)24 h后，與單純?nèi)毖踅M相比，salubrinal預(yù)給后增加細(xì)胞活力，細(xì)胞ATP含量顯著上升，見圖3。

Figure 3. The protective effect of salubrinal(Sal)on hypoxic cardiomyocytes±s.n=3.#P＜0.05 vs hypoxia+ Sal(0 μmol/L)group;*P＜0.05 vs control group.圖3 不同濃度salubrinal對缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

4 缺氧對心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子的影響

4.1 缺氧對心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子(鈣網(wǎng)蛋白和GRP78)表達(dá)的影響 與正常對照相比，缺氧1 h，心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活蛋白GRP78、鈣網(wǎng)蛋白顯著增加，其中鈣網(wǎng)蛋白較對照組高72%(P＜0.05)，見圖 4A，GRP78較對照組高 65%(P＜0.05)，見圖4B;但隨著缺氧時間的延長，鈣網(wǎng)蛋白在缺氧4、8和12 h與對照組表達(dá)量相當(dāng)，缺氧24 h顯著低于對照組;而GRP78在缺氧4、8 h與對照組表達(dá)量相當(dāng)，缺氧12 h、24 h顯著低于對照組。上述結(jié)果表明，心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子鈣網(wǎng)蛋白和GRP78表達(dá)均呈現(xiàn)早期升高，后期下降的趨勢。

4.2 缺氧對PERK和eIF2α磷酸化水平及ATF4蛋白表達(dá)的影響 Western blotting測定結(jié)果顯示，與正常對照組相比，從缺氧 1 h起，心肌細(xì)胞 p－PERK/PERK開始顯著升高，至缺氧4 h，p－PERK/ PERK達(dá)到最大，較對照組高73%，隨后逐漸下降，見圖5A，缺氧8 h仍保持較高水平，但到12 h后則低于對照水平;缺氧心肌細(xì)胞eIF2α的磷酸化水平也是從缺氧1 h起開始顯著升高，至缺氧4 h，peIF2α/eIF2α達(dá)到最大，較對照組高87%(P＜0.05)，見圖5B，隨后雖逐漸下降，但直至缺氧24 h仍然保持較高表達(dá)水平;對照組ATF4不表達(dá)，缺氧后，細(xì)胞中ATF4蛋白表達(dá)量升高，在4 h達(dá)到最高峰，隨后顯著下降(P＜0.05)，見圖5C，但至缺氧24 h仍有表達(dá)。

Figure 4. Effect of hypoxia on calreticulin(A)and GRP78(B)protein expression.珋x±s.n=3.*P＜0.05 vs control(0 h)group.圖4 缺氧不同時間對鈣網(wǎng)蛋白和GRP78蛋白表達(dá)的影響

Figure 5. Effect of hypoxia on p－PERK/PERK(A)，p－eIF2α/eIF2α(B)and ATF4(C)protein expression.珋x±s.n=3.*P＜0.05 vs control(0 h)group.圖5 缺氧不同時間對p－PERK/PERK、p－eIF2α/eIF2α及ATF4蛋白表達(dá)的影響

4.3 缺氧對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性凋亡分子(CHOP)表達(dá)的影響 由免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果可以看出，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性凋亡分子CHOP在非缺氧處理的對照組和短期缺氧組心肌細(xì)胞上不表達(dá)，但在缺氧12 h和 24 h，CHOP出現(xiàn)表達(dá)?？梢?，缺氧可激活PERK通路下游的凋亡活性分子CHOP，缺氧12 h心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白達(dá)到較高水平(P＜0.05)，見圖6。

Figure 6. Effect of hypoxia on CHOP protein expression.A:the representative images of high－content analysis(×200);B:the fluorescence intensity analysis of CHOP.珋x±s.n=3.*P＜0.05 vs control(0 h)group.圖6 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測缺氧對CHOP蛋白表達(dá)水平的影響

討論

組織缺氧是指因氧氣供應(yīng)不足或用氧障礙，而導(dǎo)致組織代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化的病理過程［9－10］。心肌缺氧可導(dǎo)致以細(xì)胞壞死和凋亡為特征的心肌細(xì)胞損傷。近年研究表明，ERS相關(guān)的凋亡途徑與缺氧誘發(fā)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［11－12］。UPR保護(hù)性機制主要由2條相對獨立的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜分子介導(dǎo)信號通路來調(diào)控:一條是IRE1和ATF6途徑，即IRE1和ATF6通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶使未折疊或錯誤折疊蛋白恢復(fù)正確構(gòu)像，終止ERS和細(xì)胞凋亡;另一條是PERK途徑，即PERK在翻譯水平抑制蛋白合成，減少未折疊蛋白，最終促進(jìn)ERS恢復(fù)，減少細(xì)胞凋亡。有實驗表明ATF6和IRE1通路參與了缺氧誘發(fā)的心肌細(xì)胞ERS及凋亡。本實驗在體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)，PERK通路在缺氧心肌細(xì)胞損傷中起到重要的作用，缺氧不僅能夠在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期激活UPR的PERK通路，對心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時間延長，還能夠激活其下游的凋亡信號分子，激活凋亡通路，引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡。

本實驗將原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞置于密閉的恒溫缺氧倉內(nèi)，通入95%N2/5%CO2混合氣體，氧氣含量少于0.5%，模擬體內(nèi)心肌細(xì)胞缺氧環(huán)境。以ATP含量作為細(xì)胞活力的檢測指標(biāo)，結(jié)果顯示，隨著缺氧時間的延長，細(xì)胞活力明顯降低，但在缺氧早期，大約4 h，細(xì)胞活力有所逆轉(zhuǎn)。多參數(shù)檢測細(xì)胞凋亡的實驗同樣發(fā)現(xiàn)，在缺氧時間延長至12 h，無論從細(xì)胞的核亮度，還是線粒體膜電位及肌動蛋白含量的改變上來看，心肌細(xì)胞均表現(xiàn)出明顯的凋亡特征，但在缺氧早期表現(xiàn)出輕微逆轉(zhuǎn)。這說明在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期，有一種保護(hù)性作用的存在對抗由缺氧引起的心肌細(xì)胞損傷。本實驗設(shè)計不同缺氧時間體現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對心肌細(xì)胞造成損傷的不同。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的感受器，在監(jiān)測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白質(zhì)的聚集和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活過程中發(fā)揮重要作用。鈣網(wǎng)蛋白為ER中主要的鈣結(jié)合伴侶蛋白，是ER貯存的重要應(yīng)激蛋白和ERS的重要標(biāo)志。本實驗中，缺氧1 h，就能上調(diào)GRP78和鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)，缺氧4、8 h與正常組表達(dá)量相當(dāng)，缺氧12、24 h顯著低于正常組，提示缺氧1 h后導(dǎo)致了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生。有文獻(xiàn)多次報道稱，在缺氧模型中，GRP78和鈣網(wǎng)蛋白作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)因子，在應(yīng)激前期被激活表達(dá)［13－14］。上述實驗現(xiàn)象與文獻(xiàn)報道一致，表明本實驗的缺氧模型是成功的。

eIF2α是ERS中PERK通路直接的調(diào)控因子，PERK通過催化eIF2α磷酸化，使GDP－eIF2α不能轉(zhuǎn)化為GTP－eIF2α，不能形成GTP－eIF2α－MettRNA/40S復(fù)合體，結(jié)果Met－tRNA的翻譯被終止，蛋白合成下降，未折疊蛋白減少等，最終促進(jìn)ERS恢復(fù)，減少細(xì)胞凋亡。Boyce等［15］報道，p－eIF2α去磷酸化抑制劑salubrinal通過激活UPR具有對抗ERS相關(guān)的PC－12細(xì)胞凋亡的作用。本實驗室前期工作也證實在原代培養(yǎng)的 Wistar大鼠心肌細(xì)胞上，salubrinal具有對抗ERS特異性誘導(dǎo)劑衣霉素(tunicamycin)引起的心肌細(xì)胞損傷的作用，并且證實salubrinal的保護(hù)作用與eIF2α的磷酸化水平相關(guān)［16］。因此，salubrinal對細(xì)胞的保護(hù)作用可以間接證明PERK通路參與了ERS相關(guān)的細(xì)胞凋亡。本實驗在缺氧誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞上，發(fā)現(xiàn)提前給予salubrinal組ATP含量較單純?nèi)毖踅M有所回升，即抑制p－eIF2α的去磷酸化，對缺氧心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。以上結(jié)果提示，缺氧激活了UPR中的PERK通路。

PERK位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，作為未折疊蛋白反應(yīng)中的重要因子，在發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時與游離的GRP78結(jié)合而使自身蛋白暴露，發(fā)生磷酸化與二聚化?；罨腜ERK蛋白進(jìn)一步使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外側(cè)的eIF2α發(fā)生磷酸化修飾，一方面通過eIF2α磷酸化抑制蛋白合成，另一方面激活下游的ATF4，ATF4合成后轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，作為轉(zhuǎn)錄因子能夠上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白并參與氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，同樣有助于恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)［17－18］。本實驗在原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞缺氧模型上檢測缺氧是否激活了PERK通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在缺氧4 h時，PERK和eIF2α磷酸化水平與對照組相比，都顯著升高。ATF4作為peIF2α的下游分子，在缺氧后4 h表達(dá)上調(diào)，明顯高于對照組。GADD153/CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異的凋亡蛋白，屬C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員。正常情況下，CHOP表達(dá)十分低，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)時，CHOP作為PERK通路的下游分子，在缺氧12 h，表達(dá)明顯增加。在哺乳動物中，調(diào)節(jié)蛋白合成是一個十分復(fù)雜的過程，我們不能夠排除其它小分子蛋白來調(diào)節(jié)蛋白合成的可能。但是我們可以推測，在缺氧早期，缺氧激活UPR中的PERK通路，并且通過PERK的磷酸化使eIF2α磷酸化，并且誘導(dǎo)ATF4表達(dá)上調(diào)，起到部分抑制未折疊蛋白合成、保護(hù)細(xì)胞的作用。但在缺氧后期，CHOP作為PERK通路的下游分子，誘發(fā)細(xì)胞心肌凋亡，是導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺氧損傷的一個重要原因。阻斷PERK通路，減少CHOP的表達(dá)，對于減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生將起到?jīng)Q定性作用，有關(guān)這方面的討論有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實驗在原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，UPR反應(yīng)中PERK通路蛋白及其下游的凋亡信號在缺氧過程中被激活，并在缺氧心肌細(xì)胞中依次表達(dá)。即ERS相關(guān)的PERK通路參與了缺氧誘發(fā)的心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡。針對PERK通路與缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷關(guān)系的研究，將有望為心肌缺血性疾病的防治提供新靶點。

［1］Wencker D，Chandra M，Nguyen K，et al.A mechanistic role for cardiac myocyte apoptosis in heart failure［J］.J Clin Invest，2003，111(10):1497－1504.

［2］Szegezdi E，Duffy A，O＇Mahoney ME，et al.ER stress contributes to ischemia－induced cardiomyocyte apoptosis［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，349(4): 1406－1411.

［3］Faitova J，Krekac D，Hrstka R，et al.Endoplasmic reticulum stress and apoptosis［J］.Cell Mol Biol Lett，2006，11(4):488－505.

［4］Davenport EL，Morgan GJ，Davies FE.Untangling the unfolded protein response［J］.Cell Cycle，2008，7(7): 865－869.

［5］Negoro S，Kunisada K，Tone E，et al.Activation of JAK/ STAT pathway transduces cytoprotective signal in rat acute myocardial infarction［J］.Cardiovasc Res，2000，47(4): 797－805.

［6］Ron D，Walter P.Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8(7):519－529.

［7］Doroudgar S，Thuerauf DJ，Marcinko MC，et al.Ischemia activates the ATF6 branch of the endoplasmic reticulum stress response［J］.J Biol Chem，2009，284(43):29735－29745.

［8］Thuerauf DJ，Marcinko M，Gude N，et al.Activation of the unfolded protein response in infarcted mouse heart and hypoxic cultured cardiac myocytes［J］.Circ Res，2006， 99(3):275－282.

［9］Gasparetto M，Gentry T，Sebti S，et al.Identification of compounds that enhance the anti－lymphoma activity of rituximab using flow cytometric high－content screening［J］.J Immunol Methods，2004，292(1－2):59－71.

［10］Natarajan R，Salloum FN，F(xiàn)isher BJ，et al.Prolyl hydroxylase inhibition attenuates post－ischemic cardiac injury via induction of endoplasmic reticulum stress genes［J］.Vascul Pharmacol，2009，51(2－3):110－118.

［11］Osada N，Kosuge Y，Ishige K，et al.Characterization of neuronal and astroglial responses to ER stress in the hippocampal CA1 area in mice following transient forebrain ischemia［J］.Neurochem Int，2010，57(1):1－7.

［12］楊 鵬，楊成明，曾春雨，等.心肌梗死后心力衰竭小鼠心肌組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑的研究［J］.中國病理生理雜志，2010，26(6):1069－1074.

［13］Minamino T，Kitakaze M.ER stress in cardiovascular disease［J］.J Mol Cell Cardiol，2010，48(6):1105－1110.

［14］Flores－Diaz M，Higuita JC，F(xiàn)lorin I，et al.A cellular UDP－glucose deficiency causes overexpression of glucose/oxygen－regulated proteins independent of the endoplasmic reticulum stress elements［J］.J Biol Chem，2004，279(21):21724－21731.

［15］Boyce M，Bryant KF，Jousse C，et al.A selective inhibitor of eIF2α dephosphorylation protects cells from ER stress［J］.Science，2005，307(5711):935－939.

［16］胡國梁，何昆侖，范 利，等.Salubrinal保護(hù)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡的實驗研究［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報，2010，31(5):483－485.

［17］Terai K，Hiramoto Y，Masaki M，et al.AMP－activated protein kinase protects cardiomyocytes against hypoxic injury through attenuation of endoplasmic reticulum stress［J］.Mol Cell Biol，2005，25(21):9554－9575.

［18］Cybulsky AV，Takano T，Papillon J，et al.Role of the endoplasmic reticulum unfolded protein response in glomerular epithelial cell injury［J］.J Biol Chem，2005，280 (26):24396－24403.

PERK signal pathway is involved in hypoxia－induced endoplasmic reticulum stress and apoptosis in cultured cardiac myocytes

LIU Chun－lei1，2，LI Xin1，LI Rui－jun1，HE Yun－yun1，2，HE Kun－lun1，WANG Li－ li3
(1Department of Cardiology，General Hospital of Chinese PLA，Beijing 100853，China;2Medical School of Nankai University，Tianjin 300071，China;3Institute of Poisons and Drugs，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China.E－mail:hekunlun2002@yahoo.com;wangll63@126.com)

AIM:To investigate the role of endoplasmic reticulum(ER)stress in the process of hypoxia－induced neonatal rat myocardial injury through PERK signal pathway.METHODS:Neonatal rat cardiac myocytes were randomly divided into control group and hypoxia 1 h，4 h，8 h，12 h and 24 h groups.Cell viability was evaluated by determining the intracellular content of ATP.Apoptosis was measured by high－content analysis(HCA)cell imaging system.The protein levels of GRP78，calreticulin，p－PERK，p－eIF2α，ATF4 and CHOP were detected by Western blotting at different time points.The primary cultured neonatal rat cardiac myocytes were treated with an agonist of PERK pathway salubrinal and the cell apoptosis was observed under hypoxia.RESULTS:In the early phase，hypoxia induced an increase in the expression of calreticulin and GPR78.In the middle phase of hypoxia，the levels of p－PERK，p－eIF2α and ATF4 were increased.In the later phase of hypoxia，increased CHOP level was also observed.Salubrinal effectively protected the cardiac myocytes from hypoxic injury.CONCLUSION:Hypoxia activates ER stress in cardiac myocytes and also activates PERK signal pathway.PERK signaling protects cardiac myocytes from hypoxic damage in the early stage and triggers apoptosis of the cells in the later phase.

Cardiomyocytes;Endoplasmic reticulum stress;Hypoxia;Unfolded protein response;Apoptosis

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2012.08.010

1000－4718(2012)08－1392－07

2012－03－02

2012－06－25

國家科技部國際科技合作重大專項課題(No.2006DFB32210)

△通訊作者Tel:010－66939685;何昆侖E－mail:hekunlun2002@yahoo.com;王莉莉E－mail:wangll63@126.com